Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각
Summary
망막 조직을 이미징 전통적인 생 화 확 적인 방법에서 수집 될 수 없는 단일 셀 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜 confocal 영상에 대 한 제 브라에서 망막 조각의 준비를 설명합니다. 형광 유전자 센서를 인코딩 또는 표시기 염료 별개 망막 세포 유형에 수많은 생물 학적 과정의 시각화를 허용.
Abstract
망막은 비전의 첫 번째 단계를 통합 하는 복잡 한 조직. 망막 세포의 기능 장애는 많은 눈부신 질병의 품질 증명 그리고 미래 치료 세포는 정상적으로 작동 하는 어떻게 다른 망막에 대 한 기본적인 이해에 경첩. 특정 종류의 기여는 망막 세포 주위에 점감 된다 때문에 생 화 확 적인 방법으로 정보를 얻고 어려운 입증 되었습니다. 라이브 망막 이미징 subcellular 수준, 유전자 인코딩된 형광 바이오 센서의 증가 덕분에 수많은 생물 학적 과정의 보기를 제공할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 지금까지 tadpoles 그리고 zebrafish 애벌레, 고립 된 망막의 바깥쪽 망막 레이어 또는 살아있는 동물에서 망막의 낮은 해상도 이미징 있었습니다. 여기 우리 confocal 현미경 검사 법을 통해 라이브 영상에 대 한 성인 제 브라에서 라이브 비보 전 망막 슬라이스를 생성 하기 위한 방법을 제시. 이 준비는 대부분 세포 유형 confocal 이미징 실험 살포를 사용 하 여 수행 볼 수와 모든 망막 레이어 가로 분할 영역 생성 합니다. 유전자 변형 zebrafish 표현 형광 단백질 또는 특정 망막 세포 유형 또는 세포 바이오 센서는 그대로 망막에서 단일 셀 정보를 추출 하는 데 사용 됩니다. 또한, 망막 조각 방법의 다양성에 추가 하는 형광 표시기 염료로 로드할 수 있습니다. 이 프로토콜 이미징 캘리포니아2 + 제 브라 콘 대뇌, 내 개발 되었습니다 하지만 적절 한 표시와 함께 그것은 수 적응 측정 캘리포니아2 + 또는 뮐러 셀, 바이 폴라 및 수평 세포, microglia, amacrine 세포, 또는 망막에서 대사 산물 신경 절 세포입니다. 이 메서드는 셀 형식을 공부에 적합 하지 않습니다 그래서 망막 안료 상피 조각에서 제거 됩니다. 연습, 여러 실험에 대 한 하나의 동물에서 직렬 슬라이스를 생성 가능 하다. 이 적응 기술에 대 한 망막 세포 생물학, 캘리포니아2 +, 에너지 항상성 많은 질문에 응답 하기 위한 강력한 도구를 제공 합니다.
Introduction
제 브라 (Danio rerio) 의료 및 기본적인 과학 연구1, 작은 크기, 빠른 개발 및 척추 기관 시스템 때문에 널리 사용 되는. Transgenesis에 대 한 설립된 방법과 결합 zebrafish 애벌레의 자연적인 투명도 살아있는 동물에서 세포 프로세스의 상세한 시각화를 사용할 수 있습니다. 다양 한 유전자 인코딩된 형광 바이오 센서는 감지 캘리포니아2 + 2, 과산화 수소3, apoptotic 활성화4 ATP5특정 zebrafish 셀에 표적이 되었습니다.
Vivo에서 화상 진 찰 zebrafish 애벌레의 신경 과학, 두뇌 회로6 의 매핑 등의 분야에서 혁신을 주도하 고 있다 및 중앙 신경 조직에 대 한 약물 개발 무질서7. Zebrafish는 비전 연구에 적합 그들의 망막 기능 구조 및 더 높은 척추 동물의 신경 종류 그리고 강력한 시각적 동작8,9표시 때문에. 여러 종류의 망막 유년 인간의 질병에 유사한 성공적으로 모델링 되 고 제 브라10,11, 망막2, 내 변질 개별 대뇌의 라이브 영상 등에서 공부 12.
애벌레 zebrafish 이미징 비보에 유용한 도구 동안, 그것은 더 많은 도전으로 물고기 성장 하 고 착 색, 개발 몇 가지 약리 치료 전체 동물을 침투 수 없습니다 된다. 또한, 특정 세포 프로세스 개발 및 나이, 성인 동물에 이해 기능과 질병의 진행에 대 한 중요 한 나중 시간 포인트를 만들고 변경 합니다. Immunoblot, quantitiative PCR, O2 소비, 및 metabolomic 분석 같은 방법을 전체적으로 망막의 생물학에 대 한 중요 한 단서를 제공할 수 있습니다 하지만 그것은 개별 종류의 세포에 의해 영향을 받는 기부를 분별 하기 어려운 생화학 질병입니다. 이러한 문제를 무시 비보 전 고립 된 망막 조직을 이미징 하 고 평면 이미징 하는 동안 탑재 된 망막 월급 외부 망막13의 보기, 깊은 내부 망막 기능 가려진. 가로 망막 조각, 그에 제시 모든 레이어 및 셀의 명확한 보기를 활성화 하려면 고정 immunohistochemical 분석 하지만 정상적인 기능 및 질병에 관련 된 동적 프로세스의 단일 스냅숏을 제공.
여기, 우리 이미징 성인 제 브라에서 비보 전 가로 망막 분할 영역을 생성 하기 위한 방법을 제시. 그것은 비슷한 electrophysiological 및 형태학 연구14,15, ex vivo 공초점 레이저를 사용 하 여 이미징 시간 경과 대 한 중요 한 수정에 대 한 수 륙 양용 그리고 zebrafish 망막 슬라이스를 준비 하기 위한 방법 현미경 검사 법입니다. 바이오 센서 또는 분할 영역에 염료의 형광 응답 약리 에이전트 관류를 사용 하 여 제공 하면서 confocal 현미경으로 실시간으로 모니터링 된다. 메서드가 대뇌 이미징 개발 되었습니다, 그것은 적절 한 형광 마커 뮐러 셀, 양극 세포, 수평 세포, amacrine 세포, 또는 망막 신경 절 세포를 시각화에 대 한 사용 가능한 수 있습니다. 또한, 조각 보고서 세포 생존 능력, 기공을 전송, 미토 콘 드 리아 기능, 또는 산화 환 원 상태에 형광 세포 투과성 염료로 로드할 수 있습니다. 이 다재 다능 한 준비는 망막, 캘리포니아2 + 역학, 대사 상태, 신호 변환 등을 통해 다양 한 subcellular 프로세스의 시각화 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신선한 zebrafish 망막 조각의 비보 전 영상 포토 리셉터 생물학20,,2122, 공부에 대 한 다양 한 도구를 것을 입증 했다 그리고 고유에서 완전히 성숙, 단일 셀의 분석 수 있습니다. 차별화 된 망막입니다. 연습으로, 망막의 동일한 부분에서 직렬 조각을 사용 하 여 단일 물고기에서 조직으로 여러 실험을 실시 가능 하다. 과제 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 랄 프 넬슨과 다니엘 Possin 안정적인 유전자 변형 zebrafish 라인의 세대를 위해이 프로토콜, 그리고에 바 Ma, 애슐리 조지 게 일 스탠 튼을 개발 하면서 생각 지도. 일 밀리, 밀리, 화장실을 NIH 네이 5T32EY007031에 NSF GRFP 2013158531 고 재 혁 고 S.B. EY026020에 의해 지원 되었다
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
Referenzen
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