Ex Vivoイメージング実験アダルト ゼブラフィッシュから準備新鮮な網膜スライス
Summary
網膜組織を撮像すると、従来の生化学的方法から収集することはできません単一セル情報が提供できます。このプロトコルでは、共焦点レーザー顕微鏡のゼブラフィッシュの網膜スライスの準備について説明します。蛍光遺伝子センサーをエンコードまたはインジケーター染料網膜細胞の多数の生物学的過程の可視化を許可します。
Abstract
網膜は、開始し、ビジョンの最初のステップを統合する複雑な組織です。網膜細胞の機能不全はまばゆいばかりの多くの病気の認刻極印、細胞は正常にどのように異なる網膜について基礎的な理解にかかっている未来の療法。網膜細胞環境で特定の細胞のタイプの貢献が減少されるため、生化学的な方法でそのような情報を得ることが困難に証明しています。ライブ眼底イメージングは、細胞レベルで、遺伝子にエンコードされた蛍光バイオ センサーの増加のおかげで、多数の生物学的プロセスのビューを提供できます。ただし、この手法については、オタマジャクシやゼブラフィッシュ幼虫、孤立した網膜の最も外側の網膜層または生きている動物の網膜の低解像度画像に制限されていますこれまで。共焦点顕微鏡を介してライブ イメージングのための大人のゼブラフィッシュからライブ前のヴィヴォ網膜スライスを生成する手法をご紹介します。この準備には、網膜のすべてのレイヤーと灌流を用いた共焦点イメージング実験を実行するため目に見えるほとんどの携帯型横スライスが得られます。トランスジェニックゼブラフィッシュ表現する蛍光タンパク質や特定の網膜細胞の種類や細胞内小器官のバイオ センサーを使用して、そのまま網膜から単一セル情報を抽出します。さらに、網膜のスライスは、蛍光指示薬染料、メソッドの汎用性を追加することでロードできます。このプロトコルは、Ca2 +ゼブラフィッシュ錐体視細胞内のイメージングのため開発されましたが、Ca2 +やミュラー細胞、バイポーラと水平細胞、ミクログリア、アマクリン細胞や網膜の代謝産物を測定する適切なマーカーを合わせることができます。神経節細胞。網膜色素上皮細胞は、このメソッドはそのセル型の勉強に適してないので、スライスから削除されます。実際には、複数の実験の 1 つの動物からシリアル スライスを生成することが可能です。この適応手法は、網膜細胞生物学、Ca2 +、およびエネルギー恒常性について多くの質問に答えるための強力なツールを提供します。
Introduction
ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、広く医療や基礎科学研究1, その小さなサイズ、急速な発展と脊椎動物の器官系のために使用となっています。遺伝子導入のための確立された方法と組み合わせてゼブラフィッシュ幼虫の自然の透明性は、生きている動物の細胞プロセスの詳細な可視化を可能にしました。遺伝的コード化蛍光バイオ センサーの数は、特定のゼブラフィッシュ細胞 Ca2 + 2過酸化水素3、アポトーシス活性化4 ATP5検知する対象となっています。
ゼブラフィッシュ幼虫のin vivoイメージング脳回路6のマッピングを含む、神経科学の分野でブレークスルーをもたらしたし、中枢神経系治療薬の開発の障害7。ゼブラフィッシュは、網膜機能層構造と高等脊椎動物の神経型、彼らは堅牢な視覚的な動作8,9を表示するためにビジョンの研究に適しています。人間の病気に類似している網膜変性のいくつかの種類を正常にモデル化されているし、ゼブラフィッシュ10,11, 個々 の視細胞変性網膜2、内のライブ イメージングなどで勉強 12。
ゼブラフィッシュ稚魚イメージング体内の貴重なツールですが、いくつかの薬理学的治療は、全体の動物を超えることはできませんし、魚が成長し、色素沈着を開発より困難となります。さらに、特定の細胞プロセス変更開発と年齢、後の時間ポイント理解機能と病気の進行に重要な大人の動物。イムノブロット、quantitiative PCR、O2消費、メタボローム解析などの生化学的な方法は、全体として網膜の生物学についての重要な手がかりを提供できますが、貢献によって影響を受ける個々 のセルの種類を見分けることは困難です。病気。これらの問題をバイパスする前のヴィヴォ孤立した網膜組織イメージングとイメージング フラット マウントされた網膜が外側の網膜13のビューを提供より深い内部の網膜の機能が隠されています。横網膜スライス、すべてのレイヤーおよびセルの種類を明確に表示を有効にするが、正常機能と疾患に関与する動的なプロセスの 1 つのスナップショットを提供するだけもので免疫組織化学的解析を固定します。
ここでは、イメージングのための大人のゼブラフィッシュから横網膜スライス前のヴィヴォを生成する手法を提案する.それは電気生理学的・形態学的研究14,15、時間経過前のヴィヴォ共焦点を使用してイメージングの重要な変更との水陸両用機およびゼブラフィッシュ網膜スライスを準備するための方法と同様顕微鏡検査。バイオ センサーやスライスで染料の蛍光反応は灌流を用いた薬理学的エージェントを提供しながら、共焦点顕微鏡を用いたリアルタイムで監視されます。メソッドは、光受容体イメージングのため開発された、適切な蛍光マーカーとミュラー細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、または網膜神経節細胞を可視化するために使用する実行可能な場合があります。さらに、スライスは、レポート セル実行可能性、小胞輸送、ミトコンドリア機能または酸化還元状態に細胞膜透過性の蛍光染料をロードできます。この多目的な準備は、Ca2 +動態、シグナル伝達、代謝の状態など、網膜全体の細胞プロセスの広い範囲の可視化をことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
新鮮なゼブラフィッシュ網膜スライスのex vivoイメージング光受容体生物学20,21,22を勉強するための多彩なツールがあると証明した、ユニークなことは完全に成熟した、単一細胞の解析を可能に差別化された網膜。練習では、網膜の同じ部分からシリアル スライスを使用して、1 つの魚からの組織と複数の実験を行う…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
思いやりのある指導を安定したトランスジェニックゼブラフィッシュの行の世代のこのプロトコル、および Eva Ma、アシュリー ジョージとゲイル ・ スタントンを開発しながら、ラルフ ・ ネルソンとダニエル Possin に感謝します。仕事は、m. g. w. c. と m. g.、NIH ネイ 5T32EY007031 に NSF GRFP 2013158531 と j. h. s. b. に EY026020 によって支持されました。
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
Referenzen
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
