Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem
Summary
Imagem tecido retinal pode fornecer informações de célula única que não podem ser obtidas por métodos bioquímicos tradicionais. Este protocolo descreve a preparação de fatias da retina de zebrafish para a imagem latente confocal. Indicador de corantes permitem a visualização de numerosos processos biológicos em tipos distintos de células da retina ou fluorescente geneticamente codificado sensores.
Abstract
A retina é um tecido complexo que inicia e integra os primeiros passos da visão. Disfunção das células da retina é uma marca registrada de muitas doenças ofuscante, e terapias futuras dependem de entendimentos fundamentais sobre como diferentes da retina células funcionam normalmente. Ganhar essa informação com métodos bioquímicos provou difícil porque as contribuições dos tipos de célula específica são diminuídas no meio de células da retina. Imagem da retina ao vivo pode fornecer uma visão dos numerosos processos biológicos em nível subcelular, graças a um número crescente de biosensores fluorescentes geneticamente codificados. No entanto, esta técnica tem sido limitada a girinos e larvas de peixe-zebra, as camadas da retina ultraperiféricas da retina isolada, ou imagens de resolução mais baixa da retina em animais vivos. Aqui nós apresentamos um método para gerar ao vivo ex vivo da retina fatias de adultos do zebrafish para geração de imagens ao vivo através de microscopia confocal. Esta preparação rende fatias transversais com todas as camadas da retina e a maioria dos tipos de células visíveis para a realização de experimentos de imagiologia confocal usando a perfusão. Zebrafish transgênicos expressando proteínas fluorescentes ou biossensores em tipos específicos de células da retina ou organelas são usados para extrair informação de célula única de uma retina intacta. Além disso, as fatias da retina podem ser carregadas com corantes fluorescentes indicador, adicionando à versatilidade do método. Este protocolo foi desenvolvido para imagem Ca2 + dentro do zebrafish cones fotorreceptores, mas com marcadores adequadas poderia ser adaptado para medir Ca2 + ou metabolitos em células Müller, células bipolares e horizontais, micróglia, células de amacrine ou da retina células ganglionares. O epithelium retinal do pigment é removido do fatias assim que este método não é adequado para estudar esse tipo de célula. Com prática, é possível gerar seriais fatias de um animal para múltiplas experiências. Esta técnica adaptável fornece uma ferramenta poderosa para responder às muitas perguntas sobre biologia celular da retina, Ca2 +e homeostase de energia.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) tem-se amplamente utilizado em pesquisa científica básica e médica1, devido ao seu tamanho pequeno, rápido desenvolvimento e sistemas de órgãos de vertebrados. A transparência natural das larvas de zebrafish combinada com métodos estabelecidos por transgênese permitiram a visualização detalhada dos processos celulares em um animal vivo. Um número de biosensores fluorescentes geneticamente codificados têm sido alvo de células específicas do zebrafish para detectar Ca2 + 2, peróxido de hidrogênio3, apoptotic ativação4 e ATP5.
Na vivo por imagens do zebrafish larvas conduziu a descobertas no campo da neurociência, incluindo o mapeamento do cérebro circuitos6 e7de distúrbios do desenvolvimento de drogas para o sistema nervoso central. Zebrafish são adequados para a pesquisa de visão porque suas retinas apresentam a estrutura laminar e tipos de neurônio de vertebrados superiores, e eles exibem comportamentos visual robusto8,9. Vários tipos dos degenerations retinais análogos à doença humana foram modelados com sucesso e estudados no zebrafish10,11, incluindo imagens ao vivo de fotorreceptores individuais degenerando dentro de uma retina2, 12.
Enquanto na vivo zebrafish larval imagiologia é uma ferramenta valiosa, torna-se mais desafiador como peixe cresce e desenvolver pigmentação, e alguns tratamentos farmacológicos não podem permear um animal inteiro. Além disso, determinados processos celulares mudam com desenvolvimento e idade, fazendo mais tarde pontos de tempo crítico para a função de compreensão e a progressão da doença em animais adultos. Métodos bioquímicos como immunoblot, quantitativo PCR, O consumo de2 e metabolómica análises podem fornecer pistas importantes sobre a biologia da retina como um todo, mas é difícil discernir contribuições de tipos de células individuais afectados pela doença. Imagem tecido retinal isolada ex vivo ignora essas questões e enquanto imagem plana montado as retinas proporciona uma vista sobre a retina exterior13, características da retina interiores mais profundas são obscurecidas. Fatias transversais da retina, como aqueles apresentados no fixo análises imuno-histoquímica, permitem uma visão clara de todas as camadas e tipos de células, mas apenas oferecem um único instantâneo dos processos dinâmicos envolvidos na doença e função normal.
Aqui, apresentamos um método para gerar ex vivo transversais da retina fatias de zebrafish adulto para a imagem latente. É semelhante aos métodos para a preparação de anfíbios e zebrafish fatias da retina para14,Estudos eletrofisiológicos e morfológicos15, com importantes modificações para o lapso de tempo de imagem ex vivo usando confocal microscopia. Respostas de fluorescência de biosensores ou corantes em fatias são monitoradas em tempo real com um microscópio confocal ao entregar agentes farmacológicos usando a perfusão. Enquanto o método foi desenvolvido por fotorreceptores de imagem, ela pode ser viável usá-lo para a visualização de células Müller, células bipolares, células horizontais, amacrine células ou células ganglionares da retina com marcadores fluorescentes apropriados. Além disso, as fatias podem ser carregadas com corantes fluorescentes de célula-permeável a viabilidade celular de relatório, transporte vesicular, função mitocondrial ou estado de redox. Esta preparação versátil permite a visualização de uma ampla gama de processos subcelulares ao longo da retina, incluindo Ca2 + dinâmica, transdução de sinal e estado metabólico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo por imagens do zebrafish frescos fatias da retina tem provado para ser uma ferramenta versátil para estudar fotorreceptoras biologia20,21,22e é o única que permite a análise de células individuais em um maduro, totalmente diferenciada de retina. Com prática, é possível realizar várias experiências com tecido de um único peixe, mesmo usando seriais fatias da mesma região da retina. Além dos desafios …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Ralph Nelson e Daniel Possin pensativa orientação durante o desenvolvimento deste protocolo e Eva Ma, Ashley George e Gail Stanton para geração de linhas de zebrafish transgênicos estável. O trabalho foi apoiado pela NSF GRFP 2013158531 de M.G., NIH NEI 5T32EY007031 de W.C. e M.G. e EY026020 de J.H. e S.B.
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
Referenzen
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
