Eine schnelle Silber Färbung Protokoll ermöglicht einfache und effiziente Erkennung von SSR-Marker mit einem Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel
Summary
Hier berichten wir über eine einfache und kostengünstige Silber Färbeprotokoll erfordert nur drei Reagenzien und 7 min von Verarbeitung und eignet sich für schnelle Generierung von qualitativ hochwertigen SSR Daten in der genetischen Analyse.
Abstract
Einfache Sequenz wiederholen (SSR) ist eine der effektivsten Marker in pflanzlichen und tierischen Genforschung und molekulare Zuchtprogramme verwendet. Silberne Färbung ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von SSR-Marker in einem Polyacrylamid-Gel. Konventionelle Protokolle für die silberne Färbung sind jedoch technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Wie viele andere biologische Labor wurden Techniken, silberne Färbung Protokolle stetig optimiert, um nachweiseffizienz zu verbessern. Hier berichten wir über eine vereinfachte silberne Färbung Methode, die deutlich reduziert Reagenz Kosten und verbessert die Erkennung Auflösung und Bildqualität. Die neue Methode erfordert zwei wesentliche Schritte (Imprägnierung und Entwicklung) und drei Reagenzien (Silbernitrat, Natriumhydroxid und Formaldehyd) und nur 7 min Verarbeitung für ein nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Im Vergleich zu bereits gemeldeten Protokolle, diese neue Methode ist einfacher, schneller und verwendet weniger chemische Reagenzien für SSR-Erkennung. Somit profitieren diese einfache, kostengünstige und effektive Silber Färbeprotokoll genetische Zuordnung und markergestützte Züchtung durch eine schnelle Erzeugung von SSR-Marker-Daten.
Introduction
Die Entwicklung von PCR-basierten Markern revolutioniert die Wissenschaft der Pflanzengenetik und Zucht1. Einfach wiederholende (SSR) Sequenzmarken gehören zu den vielseitigsten und am häufigsten verwendeten DNA-Markern. Ihre breiten Genom Abdeckung, Fülle, Genom Spezifität und Reproduzierbarkeit sind nur einige von den Vorzügen des SSR-Marker neben ihrer Vererbung Vererbung für die Erkennung von heterozygote Genotypen2. Mehrere Studien haben SSR-Marker zu untersuchen genetischen Vielfalt, Abstammung zu verfolgen, genetische kopplungskarten zu konstruieren, und ordnen Sie Gene für wirtschaftlich wichtige Eigenschaften3,4verwendet.
PCR-Produkte von SSR-Marker werden häufig getrennt, mit Agarose oder Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und dann visualisiert mit silbernen Färbung oder unter UV-Licht nach der Färbung mit Interkalation Bromid. Silberne Färbung der DNA-Fragmente in den Polyacrylamid-Gelen ist empfindlicher als die anderen Färbung Methoden5,6 und wurde weithin verwendet, um DNA-Fragmente wie SSR Marker7erkennen.
Wie viele biologische Labor-Techniken verbesserte silberne Färbung Polyacrylamid-Gele kontinuierlich seit seiner zuerst als ein Fragment Visualisierungstechnik in 19798berichtet. Die Technik wurde ursprünglich zum Nachweis von DNA-Fragmenten von Bassam Et Al. geändert. 6 im Jahr 1991 und dann im Jahr 1994 von Sanguinetti und Kollegen9 verbessert. Die Methode wurde in den letzten paar Jahrzehnten6,7,9,10,11,12,13,14 weiter optimiert , 15. jedoch haben die meisten dieser aktualisierten Versionen der Protokolle noch einige Nachteile wie hohen technischen Anspruch und lange Bearbeitungszeit zur Befestigung und Montage6, die die Anwendung dieser Protokolle7zu beschränken, 11. Eine optimale Protokoll, die kostengünstige mit hohem Wirkungsgrad von DNA-Fragment Nachweis kombiniert ist für die routinemäßige Anwendung von Silber-Färbung in der biologischen Forschung dringend notwendig.
Darüber hinaus Polyacrylamid-Gel können Geruchsstoffen und nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele unterteilt werden, und beide können zur Erkennung von SSR-Marker mit der Silber-Färbung Methode verwendet werden. Die Wirkung und die Auflösung von denen nicht unterscheiden sich erheblich, aber nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gele lassen sich besser verarbeiten und nehmen weniger Zeit16.
Das Ziel der aktuellen Studie soll auf der Grundlage der bisherigen Forschung15eine optimierte Silber Färbeprotokoll für schnelle, einfache und kostengünstige Erkennung von SSR-Marker in einem nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel im Detail zu beschreiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Waschen von Gel nach der Imprägnierung ist ein entscheidender Schritt. Unzureichende Reinigung Zeit und Wasser Volumen kann dazu führen, dass die unvollständige Entfernung der Imprägnierung Lösung auf der Oberfläche der Platte und das Gel und führen zu einem dunklen Hintergrund. Die entsprechenden Entwicklungszeit ist ein weiterer wichtiger Schritt, übermäßige Entwicklung kann dazu führen, dass ein dunkel-braunen Hintergrund mit kontrastarmen Bild von DNA-Fragmenten. Darüber hinaus beeinflusst die Impräg…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Guangdong Natural Science Foundation of China (2015A030313500), der provinziellen Key International Cooperative Forschungsplattform und der großen wissenschaftlichen Forschung Projekt von Guangdong Higher Education (2015KGJHZ015), die Wissenschaft finanziert und Technologieplan Guangdong Tobacco Monopoly Verwaltung (201403, 201705), der Wissenschaft und Technologieplan von Guangdong China (2016B020201001), der nationalen Innovationssysteme Ausbildungsprojekt für Studierende (201711078001). Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dieser Publikation ist ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referenzen
- Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).
