Un rápido plata tinción protocolo permite Simple y detección eficiente de marcadores SSR utilizando un Gel de poliacrilamida no desnaturalizantes
Summary
Aquí, Divulgamos un protocolo que requiere sólo tres reactivos y 7 min de tratamiento y es conveniente para la generación rápida de datos SSR de calidad en el análisis genético de tinción de plata sencilla y de bajo costo.
Abstract
Repetición de secuencia simple (SSR) es uno de los marcadores más eficaces utilizados en investigación genética animal y vegetal y programas de mejoramiento genético molecular. Plata es un método ampliamente utilizado para la detección de marcadores SSR en un gel de poliacrilamida. Sin embargo, los protocolos convencionales para la tinción de plata son técnicamente exigente y requiere mucho tiempo. Como muchos otros laboratorio biológico técnicas, protocolos de tinción de plata han sido constantemente optimizadas para mejorar la eficiencia de detección. Aquí, Divulgamos un simplificado plata tinción que significativamente reduce los costos de reactivos y mejora la claridad de la resolución y la imagen de detección. El nuevo método requiere de dos pasos principales (impregnación y desarrollo) y tres reactivos (nitrato de plata, hidróxido de sodio y formaldehído) y sólo 7 minutos de procesamiento para un gel de poliacrilamida no desnaturalizantes. En comparación con protocolos previamente divulgados, este nuevo método es más fácil, más rápido y utiliza menos reactivos químicos para detección de SSR. Por lo tanto, este protocolo de tinción de plata simple, bajo costo y efectiva beneficiará a Cartografía genética y selección asistida por marcador por una generación rápida de datos de marcadores SSR.
Introduction
El desarrollo de marcadores basados en PCR ha revolucionado la ciencia de la genética de plantas y cría1. Marcadores (SSR) repetición de secuencia simple están entre los marcadores de ADN más versátiles y más utilizados. Su genoma amplio cobertura, abundancia, especificidad de genoma y repetibilidad son algunas de las ventajas de los marcadores SSR además de su herencia codominante para la detección de genotipos heterocigotos2. Varios estudios han utilizado marcadores SSR para investigar la diversidad genética, rastrear ancestros, construir mapas de ligamiento genético y mapa de genes para rasgos económicamente importantes3,4.
Productos PCR de marcadores SSR comúnmente son separados usando la electroforesis del gel de poliacrilamida o agarosa y entonces visualizado con tinción de plata o bajo luz UV después de la tinción con bromuro de etidio. Tinción de plata de fragmentos de ADN en geles de poliacrilamida es más sensible que los otros tinción métodos5,6 y ha sido ampliamente utilizado para detectar fragmentos de ADN como marcadores SSR7.
Como muchas técnicas de laboratorio biológico, tinción plata de geles de poliacrilamida ha mejorado constantemente desde su ser reportada por primera vez como una técnica de visualización de fragmento en 19798. La técnica fue modificada inicialmente para la detección de fragmentos de ADN por Bassam et al. 6 en 1991 y luego mejorado por Sanguinetti y compañeros de trabajo9 en 1994. El método se ha optimizado aún más en el pasado pocas décadas6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. sin embargo, la mayoría de estas versiones actualizadas de los protocolos tiene algunas desventajas como la alta demanda técnica y largo proceso de un tiempo de fijación y montaje6, que limitan la aplicación de estos protocolos7, 11. Un protocolo óptimo que combina el bajo costo con alta eficiencia de la detección del fragmento de ADN es urgente para la aplicación rutinaria de plata coloración en la investigación biológica.
Además, gel de poliacrilamida se puede dividir en geles de poliacrilamida de desnaturalización y no desnaturalizar, y tanto pueden ser utilizados para la detección de marcadores SSR utilizando el método de tinción de plata. El efecto y cuya resolución no difieren significativamente, pero los geles de poliacrilamida no desnaturalizantes son fáciles de procesar y tomar menos tiempo16.
Sobre la base de la investigación anterior15, el objetivo del presente estudio es describir un protocolo en detalle para la detección rápida, fácil y de bajo costo de marcadores SSR en un gel de poliacrilamida no desnaturalizantes de tinción de plata optimizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
El lavado del gel después de la impregnación es un paso crítico. Volumen de agua y tiempo de lavado puede causar la extirpación incompleta de la solución de impregnación en la superficie de la placa y el gel y resultar en un fondo oscuro. El momento adecuado del desarrollo es otro paso clave, desarrollo excesivo puede resultar en un fondo marrón oscuro con imagen de bajo contraste de fragmentos de ADN. Además, el paso de impregnación afecta significativamente la eficiencia tinción de fragmentos de ADN. Aunque e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias naturales en Guangdong de China (2015A030313500), la plataforma de investigación Provincial, clave internacional cooperativa y los principales científicos investigación proyecto de Guangdong educación superior (2015KGJHZ015), la ciencia y Plan de tecnología de administración de monopolio de tabaco de Guangdong (201403, 201705), la ciencia y tecnología Plan de Guangdong de China (2016B020201001), el proyecto de formación de innovación nacional para estudiantes de pregrado (201711078001). Mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades y el empleador.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referenzen
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