빠른 실버 얼룩 프로토콜 사용 간단 하 고 효율적인 탐지의 SSR 마커는 비 변성 시키기 Polyacrylamide 젤을 사용 하 여
Summary
여기, 우리는 간단 하 고 저가 실버 3 시 약 및 처리의 7 분 이며 유전자 분석에 높은-품질 SSR 데이터의 빠른 생성을 위한 적합 한 프로토콜을 얼룩이 지를 보고 합니다.
Abstract
간단한 순서 반복 (SSR) 식물과 동물 유전자 연구 및 분자 breeding 프로그램에서 사용 하는 가장 효과적인 마커 중 하나입니다. 실버 얼룩 polyacrylamide 젤에 SSR 마커 검출에 대 한 널리 사용 되는 방법입니다. 그러나, 실버 얼룩에 대 한 전통적인 프로토콜은 기술적으로 요구 하 고 시간이 많이 걸리는. 다른 많은 생물학 실험실 처럼 기법, 프로토콜을 얼룩이 지 실버는 검출 효율 향상을 위해 꾸준히 최적화 되었습니다. 여기, 우리 보고 단순화 된 실버 얼룩 메서드를 크게 시 약 비용 감지 해상도 사진 선명도 향상 시킵니다. 새로운 메서드는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 대 한 두 가지 주요 단계 (임신 및 개발) 및 3 개의 시 약 (실버 질산염, 수산화 나트륨, 그리고 포름알데히드), 그리고 처리의 불과 7 분을 필요합니다. 이전에 보고 된 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 쉽습니다, 빨리 그리고 SSR 탐지에 대 한 더 적은 화학 시 약을 사용 하 여. 따라서,이 간단 하 고, 낮은-비용, 고 효과적인 실버 프로토콜을 얼룩이 지는 유전 매핑 및 SSR 마커 데이터의 빠른 세대 번 식 마커 기반 도움이 됩니다.
Introduction
PCR 기반 마커의 개발 식물 유전학 및 번 식1의 과학을 혁명을 했다. 간단한 순서 반복 (SSR) 마커는 가장 일반적으로 사용 되 고 가장 다재 다능 한 DNA 마커 중입니다. 그들의 게놈을 광범위 한 범위, 풍부, 게놈 특이성 및 반복성 heterozygous genotypes2의 검출에 대 한 그들의 codominant 상속 뿐만 아니라 SSR 마커의 장점 중 일부입니다. 여러 연구 결과 유전적 다양성 조사, 가계를 추적, 유전 결합 지도, 구성 및 경제적으로 중요 한 특성3,4에 대 한 유전자 지도를 SSR 마커를 사용 했습니다.
SSR 마커의 PCR 제품 agarose 또는 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 및 다음 ethidium 평범한 사람으로 얼룩 후 또는 UV 빛은 얼룩과 시각에 일반적으로 구분 됩니다. Polyacrylamide 젤에서 DNA 파편의 얼룩은 다른 착 색 방법5,6 보다 더 민감한 이며 SSR 마커7같은 DNA 파편을 검출 하기 위하여 널리 이용 되는.
많은 생물학 실험실 기술 처럼 polyacrylamide 젤의 얼룩은 꾸준히 그것의 처음 보고 되 고 19798조각 시각화 기술로 개선 했다. 기술은 처음 Bassam 외. 여 DNA 파편의 탐지에 대 한 수정 6 1991 년에 1994 년에 Sanguinetti와 동료9 을 향상. 메서드는 더는 지난 몇 년간6,7,9,10,11,12,13,14 에서 최적화 되었습니다. , 그러나 15., 프로토콜의 업데이트 된 버전의 대부분 아직도 이러한 프로토콜7의 응용 프로그램을 제한 하는 등 기술 수요 및 긴 처리 시간이 고정을 위한 장착6, 몇 가지 단점이 있다 11. DNA 조각 검출의 높은 효율성과 낮은 비용을 결합 하는 최적의 프로토콜은 생물학 연구에서 얼룩의 일상적인 응용 프로그램 긴급 하 게 필요 합니다.
또한, polyacrylamide 젤 변성 및 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤으로 분할 될 수 있다 그리고 둘 다 SSR 마커 얼룩 방법 실버를 사용 하 여 검색에 사용할 수 있습니다. 효과 해상도는 크게 차이가 없습니다, 하지만 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 프로세스를 쉽게 하 고 적은 시간16.
이전 연구15기준 현재 연구의 목표는 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 SSR 마커, 쉽고 빠르고 저렴 한 비용 검색 상세에서 프로토콜을 얼룩이 지는 최적화 된 실버를 설명 하기 위해입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
임신 후 젤의 세척은 중요 한 단계 이다. 부족 세척 시간 및 물 볼륨 접시와 젤의 표면에 침 솔루션의 불완전 한 제거 발생 하 고 어두운 배경에서 발생할 수 있습니다. 적절 한 개발에 또 다른 핵심 단계 이다,-개발 DNA 파편의 낮은 콘트라스트 이미지와 함께 어두운 갈색 배경에서 발생할 수 있습니다. 또한, 임신 단계 DNA 파편의 착 효율을 크게 영향을 줍니다. 임신 시간 5 분 이상 확장 또는 증가 임…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 광 동 자연 과학 재단의 중국 (2015A030313500), 지방 키 국제 협동 연구 플랫폼 및 주요 과학 연구 프로젝트의 광 동 등 교육 (2015KGJHZ015), 과학에 의해 투자 되었다 고 광 동 담배 독점 관리 (201403, 201705), 과학 학부 학생 (201711078001) 국가 혁신 교육 프로젝트 (2016B020201001), 중국의 광 동의 기술 계획의 기술 계획. 상호 또는이 간행물에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부는 평등한 기회 제공 및 고용주입니다.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referenzen
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