Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama
Summary
Burada, sadece üç reaktifler ve 7 min işleme gerektirir ve yüksek kaliteli SSR veri genetik analiz hızlı üretimi için uygundur Protokolü boyama basit ve düşük maliyetli bir gümüş raporu.
Abstract
Basit dizi tekrar (SSR) bitki ve hayvan genetik araştırma ve moleküler ıslah programlarında kullanılan en etkili işaretleri biridir. Gümüş boyama SSR işaretleri polyacrylamide jel içinde tespiti için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ancak, gümüş boyama için geleneksel teknik olarak zor ve zaman alıcı iletişim kurallarıdır. Gibi birçok biyolojik laboratuvar teknikleri, iletişim kuralları boyama gümüş sürekli algılama verimliliği artırmak için optimize edilmiştir. Burada, önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve algılama çözünürlük ve görüntü netliğini artırır yöntem boyama basitleştirilmiş bir gümüş raporu. Yeni yöntem için sigara denaturing polyacrylamide jel iki önemli adım (emprenye ve geliştirme) ve üç reaktifler (Gümüş nitrat, sodyum hidroksit ve formaldehit) ve sadece 7 dakika işleme gerektirir. Daha önce raporlanmış iletişim kurallarına göre bu yeni yöntem daha hızlı, daha kolaydır ve daha az kimyasal reaktifler SSR algılama için kullanır. Bu nedenle, bu basit, düşük maliyetli ve verimli gümüş Protokolü boyama genetik haritalama ve marker-yardım etmek üreme SSR işaretçisi veri hızlı bir nesil tarafından yararlanacaktır.
Introduction
PCR tabanlı işaretleri gelişimi bilim üreme1ve bitki genetik devrim yarattı. Basit sıralı tekrar (SSR) işaretleri arasında en sık kullanılan ve en çok yönlü DNA işaretlerine vardır. Onların geniş genom kapsamı, bereket, genom özgüllük ve tekrarlanabilirlik heterozigoz genotip2tespiti için ek olarak kendi codominant devralma SSR işaretleri yararları bazılarıdır. Çeşitli çalışmalarda SSR işaretleri genetik çeşitlilik araştırmak, soy izlemek, genetik bağlantı haritalar oluşturmak ve ekonomik açıdan önemli özellikleri3,4için gen eşlemek için kullandık.
PCR ürünleri SSR işaretleri kullanarak özel veya polyacrylamide Jel Elektroforez ve etidyum bromür ile boyama sonra gümüş boyama ile veya UV ışığı altında görüntülenir yaygın olarak ayrılır. Polyacrylamide jeller DNA parçalarının gümüş boyama diğer boyama yöntemleri5,‘6 dan daha duyarlı ve yaygın olarak DNA parçalarının SSR işaretleri7gibi algılamak için kullanılan.
Gibi birçok biyolojik laboratuvar teknikleri, gümüş polyacrylamide jeller boyama giderek onun ilk bir parçası görselleştirme teknik 19798‘ olarak rapor ediliyor beri geliştirdi. Teknik DNA parçalarının tespiti için başlangıçta Bassam vd tarafından güncellenmiştir 6 1991 ve 1994 yılında Sanguinetti ve iş arkadaşlarınızla9 tarafından geliştirilmiş. Yöntem daha son birkaç on yıl6,7,9,10,11,12,13,14 ‘ te optimize , 15. ancak, iletişim kurallarının Güncellenme Zamanı bu sürümleri çoğu hala bu protokolleri7uygulama sınırı, yüksek teknik talep ve uzun süre fiksasyon için işleme ve6, montaj gibi bazı dezavantajları var 11. DNA parçası algılama yüksek verimlilik ile düşük maliyetli birleştiren bir en iyi Protokolü acilen biyolojik araştırmada boyama gümüş rutin uygulama için gereklidir.
Buna ek olarak, polyacrylamide jel denaturing ve sigara denaturing polyacrylamide jeller bölünmüş olabilir ve her ikisi de gümüş boyama yöntemi kullanarak SSR işaretleri tespiti için kullanılabilir. Etkisi ve kararlılık-in hangi önemli ölçüde farklı değildir, ama sigara denaturing polyacrylamide jeller süreci daha kolay ve daha az zaman16almak.
Önceki araştırma15temel alınarak, geçerli çalışmanın amacı ayrıntılı SSR işaretleri bir sigara denaturing polyacrylamide jel içinde hızlı, kolay ve düşük maliyetli algılanması için protokol boyama en iyi duruma getirilmiş bir gümüş tarif etmektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jel yıkandıktan sonra emprenye kritik bir adımdır. Yetersiz yıkama zaman ve su hacmi plaka ve jel yüzeyi üzerinde emprenye çözüm eksik kaldırılmasına neden ve karanlık bir arka planda neden. Uygun gelişmekte olan zaman başka bir önemli adım, aşırı geliştirme koyu kahverengi arka plan DNA parçalarının düşük kontrast görüntü ile sonuçlanabilir. Buna ek olarak, emprenye adım DNA parçalarının boyama verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Her ne kadar boyama kalite emprenye süresi 5 dk …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Guangdong doğal Bilim Vakfı Çin (2015A030313500), il anahtar uluslararası kooperatif araştırma platformu ve büyük bilimsel araştırma projesi, Guangdong Yükseköğretim (2015KGJHZ015), bilim tarafından finanse edildi ve Teknoloji planı Guangdong tütün tekel Yönetim (201403, 201705), bilim ve teknoloji planı Guangdong, Çin (2016B020201001), Ulusal İnovasyon eğitimi projesi için lisans öğrencileri (201711078001). Ticari adlar veya ticari ürünler bu yayındaki söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya bize Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işveren olduğunu.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referenzen
- Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).
