جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتوليد الأنسولين معربا عن بانكريتويدس مورين 3D من التعويم الحر e10.5 نات المتكفل البنكرياس و mesenchyme المرتبطة بها.
Abstract
البنكرياس هو جهاز معقد يتألف من العديد من أنواع الخلايا المختلفة التي تعمل معا لتنظيم التوازن جلوكوز الدم والهضم. تتضمن هذه الأنواع خلية إفراز إنزيم الخلايا أسينار، نظام الأقنية أربوريزيد مسؤولة عن نقل الإنزيمات بخلايا الأمعاء، وإنتاج هرمون الغدد الصماء.
خلايا بيتا الغدد الصماء هي نوع الخلايا الوحيدة في الجسم التي تنتج الأنسولين إلى انخفاض مستويات الجلوكوز في الدم. مرض السكري، وهو مرض يتسم بفقدان أو اختلال وظيفي في خلايا بيتا، أبعادا وبائية. وبالتالي، من الضروري وضع بروتوكولات للتحقيق في تطوير خلايا بيتا التي يمكن استخدامها لأغراض الفرز لاشتقاق المخدرات والمداواة يستند إلى الخلية. بينما التحقيق التجريبي لتطوير الماوس أساسي، في فيفو الدراسات شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. الخلايا المستزرعة توفر منصة أكثر ملاءمة للفحص؛ ومع ذلك، فغير قادر على الحفاظ على تنوع الخلوية ومنظمة المعمارية، والتفاعلات الخلوية العثور على في المجراة. ولذلك، من الضروري استحداث أدوات جديدة للتحقيق في أورجانوجينيسيس البنكرياس وعلم وظائف الأعضاء.
تطوير البنكرياس الخلايا الظهارية في ارتباط وثيق مع ميسينتشيمي من بداية أورجانوجينيسيس كخلايا تنظيم وتفرق في الجهاز الكبار المعقدة، والناحية الفسيولوجية المختصة. ميسينتشيمي البنكرياس يوفر إشارات هامة لتنمية الغدد الصماء، كثير منها ليست مفهومة جيدا حتى الآن، وبالتالي يصعب أن الخص خلال الثقافة في المختبر . هنا، نحن تصف وضع بروتوكول للثقافة أورجانويدس الماوس معقدة ثلاثية الأبعاد، والخلوية التي تحتفظ ميسينتشيمي، يسمى بانكريتويدس. برعم البنكرياس مورين e10.5 تشريح، وفصلها، ومثقف في بيئة خالية من السقالة. هذه الخلايا العائمة تجميع ذاتي مع mesenchyme تخيم بانكريتويد النامية وعدد قوية من خلايا بيتا الغدد الصماء النامية جنبا إلى جنب مع خلايا مجرى الهواء وفي أسينار. يمكن استخدام هذا النظام لدراسة التفاعلات خلية خلية خلية تحديد مصير والتنظيم الهيكلي و morphogenesis، أثناء أورجانوجينيسيس، أو للمخدرات أو جزيء صغير، أو الفحص الوراثي.
Introduction
تحديد آليات التطور الطبيعي والفسيولوجيا أمر بالغ الأهمية لفهم مسببات المرض وغرس أساليب العلاج في نهاية المطاف. حين استزراع والتفريق بين الخلايا الجذعية تمكن التحليل السريع والفائق للتنمية، فإنه مقيد بالهيئة الحالية للمعرفة فيما يتعلق بالآليات التي تنظم مصير الخلية ومصطنع ويجمل التنمية في نسبيا الدولة متجانس، ثنائي الأبعاد1،2. في فيفو التنمية تتأثر التأثيرات الخارجية، مع أنواع مختلفة من الخلايا في مكانة والوسط تقدم إشارات باراكريني والدعم التنظيمي لتوجيه أورجانوجينيسيس، بل ووظيفة هذه الخلايا يعتمد أيضا على ما المناطق المحيطة بها للإرشاد3،،من45. ونظرا لأهمية هذه الإشارات الخارجية، والقيود المفروضة على بروتوكولات التمايز، وطبيعة شاقة في فيفو نماذج الماوس، يلزم نظم جديدة للتحقيق تجريبيا في العمليات الإنمائية الأساسية وعلم وظائف الأعضاء.
ظهور البروتوكولات لتوليد أورجانويدس ثلاثي الأبعاد والمعقدة توفر نظام مريحة والمنسجمة لدراسة علم وظائف الأعضاء وفعالية المخدرات، أورجانوجينيسيس والمرضية حتى. إنشاء موريني أورجانويدس لأنظمة مختلفة مثل6 والأمعاء المعدة7 توسيع فهمنا أورجانوجينيسيس، وتوفير أداة لدراسة التعقيدات الإنمائية مع قيود أقل من فيفو ونماذج في المختبر . نظراً لأوجه التقدم هذه في أورجانويد مورين تشكيل وظهور pluripotent البشرية الجذعية الكلي10،11، الشبكية9خلايا، المعوية البشرية8، وتم إنتاج أورجانويدس الدماغي12 ، وهذا مرجع ممارسات مجلس الأمن يقتصر فقط بالمعارف القائمة بشأن آليات التنمية.
أهمية خاصة هو جيل أورجانويدس البنكرياس، كما أن عددا كبيرا من الأمراض يصيب أنواع مختلفة من خلايا البنكرياس، بما في ذلك الخلايا أسينار والقنوات في قصور إفرازات البنكرياس13، خلايا acinar في البنكرياس14، و خلايا بيتا في15من مرض السكري. اكتساب المعارف المتعلقة بتطوير هذه الأنواع المختلفة من الخلية يمكن أن تساعد في فهم هذه الأمراض ويمكن، أيضا، بمثابة منصة لفحص المخدرات شخصية أو زرع الأعضاء. سابقا، جريجيو et al. وضعت طريقة لإنشاء أورجانويدس البنكرياس مورين أن الخص في فيفو morphogenesis وتطوير هياكل المنظمة وثلاثية الأبعاد ومعقدة تتألف من جميع الخلايا الظهارية البنكرياس أنواع16،17. هذا خطوة رئيسية إلى الأمام في مجال البنكرياس، خلايا خاصة صنع في المختبر يمكن تمكين التحقيق البيولوجي لتطوير خلايا بيتا. ومع ذلك، شكلت ندرة خلايا الغدد الصماء في هذا البروتوكول إلا أورجانويدس تم زرع الأنسجة، حيث يمكن أن تتفاعل المكانة وتقديم العظة التعليمية17. Mesenchyme تشكل الجزء الأكبر من المكانة، بشدة تخيم ظهارة النامي من المراحل المبكرة من أورجانوجينيسيس إلى مراحل لاحقة، بما في ذلك تنسل الأطراف الغدد الصماء والتمايز3،4، 18. التفاعل بين ميسينتشيمي البنكرياس النامية مثال آخر الإشارات الخارجية وأهمية الحفاظ على تعقيد الخلوية في فيفو بدراسة أورجانوجينيسيس.
هنا، نحن تصف كيفية توليد ثلاثي الأبعاد أورجانويدس البنكرياس، يسمى بانكريتويدس، من أجداد البنكرياس مورين e10.5 منفصلان. هذه بانكريتويدس الاحتفاظ mesenchyme الأصلية وتجميع ذاتي في شروط التعويم الحر، وتوليد جميع أنواع الخلايا البنكرياس الرئيسية، بما في ذلك عدد قوية من خلايا بيتا الغدد الصماء19. وهذا النهج الأنسب لتحليل التنمية الغدد الصماء، والبروتوكولات السابقة تفتقر إلى التمايز الغدد الصماء قوية. ومع ذلك، استخدام البروتوكول للبنكرياس أورجانويدس كما وصفها جريجيو et al. أكثر ملاءمة لتحليل المتفرعة الظهارية البنكرياس و morphogenesis، كالتفريع هو محدودة أكثر في بانكريتويدس.
Protocol
Representative Results
Discussion
تطور نماذج ثقافة الخلية أمر بالغ الأهمية لتطوير النموذج بشكل صحيح، إنتاج أنواع الخلايا ذات الصلة سريرياً أو اختبار المخدرات فعالية زرع حتى للمرضى. بيد مصطنع أتصدى التنمية في طبق تتحدى كما أننا لا نزال بعيدين عن فهم آليات organogenesis وفسيولوجيا المجراة في. وهكذا الخلايا في المختبر ال…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر جولانتا تشميلوويك لمناقشة مفيدة بشأن البروتوكول والمخطوطة. ونشكر أيضا بنيامين أرينكيل للوصول إلى مجهر [كنفوكل]. هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة (P30-DK079638 إلى M.B.) و T32HL092332-13 إلى ماس و M.B.، ومؤسسة طبية ماكنير (إلى م)، والأساسية [كنفوكل] في مركز أبحاث العاهات الخلقية والفكرية بليون متر مكعب (المعاهد الوطنية للصحة U54 HD083092 من أونيس كينيدي شريفر المعهد الوطني للطفل الصحة والتنمية البشرية).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referenzen
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neurowissenschaften. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
