דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את…
Abstract
הלבלב הוא שאיבר מורכב מורכב רבים לסוגי תאים שונים לעבוד יחד כדי לווסת הומאוסטזיס הגלוקוז הדם והעיכול. סוגי תאים אלה כוללים מפריש אנזימים תאים acinar, מערכת ductal arborized אחראי להובלה של אנזימי התאים האנדוקריניים במעיים, הורמונים.
בטא-תאים אנדוקריני הם סוג התא היחיד בגוף המייצרים אינסולין כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם. סוכרת, מחלה המאופיינת על ידי לאובדן או את תפקוד תאי בטא-מגיע לממדים של מגיפה. לכן חיוני להקים פרוטוקולים כדי לחקור את התפתחות תאי בטא יכול לשמש לסינון למטרות להפיק את התרופה ואת מבוססת תא הרפוי. בעוד חקירה ניסויית של פיתוח העכבר הוא חיוני, אין ויוו מחקרים הם מפרך ולגזול. תאים בתרבית מספקים פלטפורמה נוחה יותר להקרנה; עם זאת, הם אינם מסוגלים לשמור על גיוון הסלולר, ארגון אדריכלי, אינטראקציות סלולרי נמצאו ויוו. לכן חיוני לפתח כלים חדשים לחקור organogenesis הלבלב ופיזיולוגיה.
תאים אפיתל הלבלב לפתח בשיתוף הדוק עם מזנכימה מראשית organogenesis תאים לארגן, להבדיל לתוך האיבר למבוגרים מורכבות, כשיר מבחינה פיזיולוגית. הלבלב מזנכימה מספק אותות חשוב לפיתוח האנדוקרינית, שרבים מהם אינם מובנים היטב, ולכן קשה לסכם במהלך התרבות במבחנה . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול organoids תלת מימדי, תאי עכבר מורכבים תרבות לשמור מזנכימה, הנקרא pancreatoids. ניצן הלבלב מאתר e10.5 גזור, חלופה מועדפת, תרבותי בסביבה נטולת לגרדום. אלו צפים תאים בעצמם עם מזנכימה עוטף את pancreatoid המתפתח ומספר תאי הבטא האנדוקרינית לפתח את acinar, את התאים צינור חזקים. מערכת זו ניתן ללמוד את האינטראקציות תא-תא תא גורל נחישות הארגון מבניים, מורפוגנזה, במהלך organogenesis, או על סמים, מולקולה קטנה, או בדיקה גנטית.
Introduction
המופקע על מנגנוני להתפתחות תקינה של הפיזיולוגיה הוא בעל חשיבות עליונה להבין מחלה אטיולוגיה ולטפח בסופו של דבר שיטות טיפול. בעוד culturing, המבדילים תאי גזע מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה ומהירה של פיתוח, הוא מוגבל על ידי הגוף קיים הידע בנושא מנגנוני ויסות גורל, באופן מלאכותי recapitulates פיתוח יחסית מדינה הומוגנית, מימדי1,2. לא רק ויוו פיתוח מושפע השפעות חיצוני, עם סוגי תאים שונים נישה, וחשש מספקת paracrine אותות ותמיכה ארגונית כדי להנחות organogenesis, אלא הפונקציה של תאים אלה מסתמך גם על שלהם הסביבה עבור הדרכה3,4,5. לאור החשיבות של אלה סימנים חיצוניים, המגבלות של בידול פרוטוקולים, מהות מפרך ויוו העכבר מודלים, מערכות חדשות נדרשים לחקור השפעול של תהליכים התפתחותיים בסיסיים ופיזיולוגיה.
הופעתה של פרוטוקולים ליצירת תלת מימדי, מורכבים organoids מספק מערכת קונגרואנטי ונוח ללמוד organogenesis, פיזיולוגיה, יעילות התרופה ו פתוגנזה אפילו. הקמת organoids מאתר עבור מערכות שונות כגון הקיבה6 ו המעי7 הרחיבו את ההבנה שלנו של organogenesis, מתן כלי ללמוד המורכבות התפתחותית עם מגבלות מועטות יותר מאשר ויוו ומודלים במבחנה . עקב ההתפתחויות הללו בתוך תא צורב מאתר היווצרות, כניסתו של אדם pluripotent גזע תאים אנושיים מעיים8, רשתית9, כליות10,11, מוחי12 organoids הופקו, ואת זה רפרטואר מוגבל רק על-ידי הידע הקיים לגבי מנגנוני התפתחות.
עניין מיוחד הוא הדור של הלבלב organoids, כמו מספר עצום של מחלות המכות סוגי התאים בלבלב, כולל תאים acinar וצינורות אי ספיקה הלבלב אקסוקרינית13, acinar תאי לבלב14ו תאי ביתא סוכרת15. רכישת ידע לגבי הפיתוח של סוגי התאים הללו יכול לסייע להבנת הפתולוגיה שלהם, גם, משמשים כפלטפורמה אישית והתרופות הקרנה או השתלת. בעבר, Greggio. ואח פיתח שיטה ליצירת organoids הלבלב מאתר זה מסכם את הדברים ויוו מורפוגנזה ולפתח מבנים מאורגנים, תלת מימדי, מתחם המורכב וכל השברים תא אפיתל הלבלב סוגי16,17. זהו צעד חשוב בשטח הלבלב, במיוחד כמו עשיית תאים במבחנה ניתן לאפשר חקירה הביולוגי של התפתחות תאי בטא. עם זאת, המחסור תאים אנדוקריני שהוקמה ב פרוטוקול זה אלא אם כן organoids היו מושתלים לתוך רקמות, איפה הנישה יכול אינטראקציה ולספק רמזים הדרכה17. מזנכימה מהווה את החלק הגדול ביותר של הגומחה, בכבדות כעוטפת האפיתל מתפתח מן בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי בשלבים מאוחרים יותר, כולל delamination האנדוקרינית ובידול3,4, 18. האינטראקציה של מזנכימה הקל המתפתח עדיין דוגמה נוספת של איתות חיצוני ואת החשיבות של שמירה על ויוו המורכבות הסלולר ללמוד organogenesis.
כאן, אנו נתאר כיצד לייצר organoids הלבלב תלת מימדי, הנקרא pancreatoids, מ e10.5 הפומבית מאתר אבות הלבלב. Pancreatoids אלה שומרים על מזנכימה מקורית, בעצמם בתנאים לתרשים ולהפיק כל סוגי תאי הלבלב העיקריים, כולל מספר חזקים של תאי הבטא האנדוקרינית19. גישה זו היא המתאימה ביותר עבור הניתוח של פיתוח האנדוקרינית, כמו פרוטוקולים הקודמים חוסר בידול האנדוקרינית חזקים. עם זאת, המשתמשים בפרוטוקול עבור organoids הלבלב כפי שתואר על ידי Greggio et al. מתאים יותר לניתוח של הסתעפות אפיתל הלבלב, מורפוגנזה, בתור הסתעפות יותר מוגבל ב- pancreatoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתקדמות של מודלים התרבות התא חיוני כראוי מודל פיתוח, לייצר סוגי תאים הרלוונטית קלינית, בדיקת תרופות יעילות או אפילו להשתלת לחולים. עם זאת, באופן מלאכותי recapitulating פיתוח בקערה הוא מאתגר כמו שאנחנו עדיין רחוק מלהיות הבנת המנגנונים של organogenesis, פיזיולוגיה ויוו. כך הם במבחנה התאים שנוצ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Jolanta Chmielowiec לדיון מועיל לגבי פרוטוקול ו כתב היד. אנו מודים גם בנג’מין Arenkiel לגישה מיקרוסקופ קונפוקלי. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (P30-DK079638 ל מ ב) ו- T32HL092332-13 M.A.S. ו מ ב מקנייר רפואי לקרן (מ ב), ליבת קונאפוקלית רוחני BCM, מרכז מחקר התפתחותיות (NIH U54 HD083092 מ יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי של הילד בריאות והתפתחות האדם).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referenzen
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neurowissenschaften. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
