Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.
Abstract
Die Bauchspeicheldrüse ist ein komplexes Organ, bestehend aus vielen verschiedenen Zelltypen, die zusammen arbeiten, um Blut-Glukose-Homöostase und die Verdauung zu regulieren. Diese Zelltypen gehören Enzym-sezernierenden acinar Zellen, einem verzweigten ductal System für den Transport von Enzymen, die Darm- und Hormon-produzierende endokrine Zellen verantwortlich.
Endokrine Beta-Zellen sind die einzige Zelltyp im Körper, die produzieren Insulin um den Blutzuckerspiegel zu senken. Diabetes, eine Krankheit, gekennzeichnet durch einen Verlust oder Dysfunktion des Beta-Zellen, erreicht epidemische Ausmaße. Daher ist es unentbehrlich, Protokolle, um Beta-Zell-Entwicklung zu untersuchen, die zu screening-Zwecken verwendet werden können, die Droge und zellbasierte Therapie ableiten. Während die experimentelle Untersuchung der Maus Entwicklung unverzichtbar ist, sind in Vivo Studien mühsam und zeitaufwändig. Kultivierte Zellen bieten eine sehr komfortable Plattform für das Screening; Allerdings sind sie nicht in der Lage, die zellulären Vielfalt, architektonische Organisation und zellulären Interaktionen gefunden zu erhalten in-vivo. Daher ist es wichtig, die Entwicklung neuer Instrumente zur Untersuchung der Pankreas Organogenese und Physiologie.
Epitheliale Zellen der Bauchspeicheldrüse entwickeln in enger Zusammenarbeit mit Mesenchym vom Beginn der Organogenese, wie Zellen zu organisieren und in das komplexe, physiologisch zuständigen Erwachsenen Organ zu unterscheiden. Die Bauchspeicheldrüse Mesenchym bietet wichtige Signale für die endokrine Entwicklung, von die viele auch noch nicht, so schwierig, während der in-vitro- Kultur rekapitulieren verstanden sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Kultur dreidimensionale, zelluläre komplexe Maus Organellen, die Mesenchym, genannt Pancreatoids zu behalten. Die e10.5 murinen Pankreas Knospe seziert, dissoziiert und in ein Gerüst-freie Umgebung kultiviert. Dieser schwimmenden Zellen zusammensetzen selbst, mit Mesenchym umhüllt die Entwicklung Pancreatoid und eine robuste Reihe von endokrinen Beta-Zellen, die zusammen mit den acinar und die Kanal-Zellen entwickeln. Dieses System kann verwendet werden, um die Zelle Schicksal Entschlossenheit, Aufbauorganisation und Morphogenese, Zell-Zell-Interaktionen während der Organogenese, oder für die Droge, kleines Molekül oder genetisches Screening studieren.
Introduction
Abgrenzung der Mechanismen für die normale Entwicklung und die Physiologie ist ausschlaggebend für die Ätiologie der Erkrankung zu verstehen und letztlich Behandlungsmethoden zu kultivieren. Während der Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen schnelle und Hochdurchsatz-Analyse der Entwicklung ermöglicht, es ist begrenzt durch die vorhandenen Körper des Wissens über Mechanismen reguliert Zelle Schicksal und künstlich rekapituliert Entwicklung in einem relativ homogene, zweidimensionalen Zustand1,2. Nicht nur in Vivo Entwicklung beeinflusst von äußeren Einflüssen, mit verschiedenen Zelltypen in der Nische und Milieu bietet Parakrine Signale und organisatorische Unterstützung, Organogenese führen, sondern die Funktion dieser Zellen beruht auch auf ihre Umgebung für Führung3,4,5. Angesichts der Bedeutung von diesen externen Cues, die Grenzen der Differenzierung Protokolle und die mühsame Art der in Vivo Mausmodelle, Neuanlagen werden mussten grundlegende Entwicklungsprozesse und Physiologie experimentell zu untersuchen.
Die Entstehung von Protokollen, dreidimensionale, komplexe Organellen zu generieren bietet eine bequeme und kongruente System zur Untersuchung der Organogenese, Physiologie, Wirksamkeit von Medikamenten und sogar Pathogenese. Gründung murine Organellen für verschiedene Systeme wie der Magen6 und Darm7 unser Verständnis der Organogenese ausgedehnt haben, bietet ein Werkzeug, um Entwicklungsstörungen Komplexität mit weniger Einschränkungen als in Vivo Studie und in-vitro- Modelle. Durch diese Fortschritte bei der murinen organoide Bildung und dem Aufkommen der menschlichen pluripotenten Stammzellen Zellen, menschlichen Darm8, retinale9, renal10,11, und zerebralen12 Organellen hergestellt wurden, und dies Repertoire ist nur durch das vorhandene Wissen über die Mechanismen der Entwicklung begrenzt.
Von besonderem Interesse ist die Generation der pankreatischen Organellen, wie eine Vielzahl von Krankheiten verschiedener Pankreas Zelltypen, einschließlich acinar Zellen und Kanälen exokrinen Pankreasinsuffizienz13acinar Zellen in Pankreatitis14, Plagen und Beta-Zellen in der Diabetes-15. Erwerb von Wissen über die Entwicklung dieser verschiedenen Zelltypen konnte helfen beim Verständnis ihrer Pathologie und fungieren darüber hinaus als Plattform für personalisierte Drogentest oder Transplantation. Zuvor, Greggio Et Al. entwickelt eine Methode zum Erstellen von murinen Pankreas Organellen, die in Vivo Morphogenese rekapitulieren und entwickeln organisierte, dreidimensionale, komplexe Strukturen bestehend aus allen wichtigen Pankreas Epithelzelle 16,17-Typen. Dies ist ein großer Schritt nach vorne im Feld Pankreas, vor allem die Zellen in Vitro können biologische Untersuchungen von Beta-Zell-Entwicklung ermöglichen. Jedoch bildeten eine Knappheit von endokrinen Zellen in diesem Protokoll, es sei denn die Organellen in Gewebe transplantiert wurden, wo die Nische könnte interagieren und didaktische Hinweise17. Das Mesenchym bildet den größten Teil der Nische, Kuvertierung stark entwickelnde Epithel von frühen Stadien der Organogenese zu späteren Phasen einschließlich endokrine Delamination und Differenzierung3,4, 18. Das Zusammenspiel von dem Mesenchym mit der entwickelnden Bauchspeicheldrüse ist noch ein weiteres Beispiel für extrinsische Signalisierung und die Bedeutung der Aufrechterhaltung der in Vivo zellulären Komplexität Organogenese zu studieren.
Hier beschreiben wir, wie dreidimensionale Pankreas Organellen, genannt Pancreatoids, von dissoziierten e10.5 murinen Pankreas Stammväter generieren. Diese Pancreatoids behalten native Mesenchym, frei schwebenden Bedingungen selbst zusammensetzen und generieren alle wichtigen Pankreas Zelltypen, einschließlich eine robuste Reihe von endokrinen Betazellen19. Dieser Ansatz eignet sich am besten für die Analyse von endokrinen Entwicklung, da frühere Protokolle robuste endokriner Differenzierung fehlt. Allerdings ist unter Verwendung des Protokolls für Bauchspeicheldrüsenkrebs Organellen wie beschrieben durch Greggio Et Al. ist besser geeignet für die Analyse der pankreatischen epithelialen Verzweigungen und Morphogenese, als Verzweigung in Pancreatoids geringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Produzieren Sie das Fortschreiten der Kultur zellmodelle ist entscheidend für richtig Modellentwicklung, klinisch relevante Zelltypen, Wirksamkeit von Medikamenten oder sogar Transplantation Patienten. Jedoch künstlich Rekapitulation Entwicklung in einer Petrischale ist eine Herausforderung, da sind wir noch weit davon entfernt, das Verständnis der Mechanismen der Organogenese und Physiologie in-vivo. So sind in-vitro- Zellen ineffizient erzeugt, nicht voll funktionsfähig, nicht für längere Zeit b…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jolanta Chmielowiec für hilfreiche Diskussion über das Protokoll und das Manuskript. Wir danken auch Benjamin Arenkiel für den Zugriff auf confocal Mikroskop. Diese Arbeit wurde unterstützt von der NIH (P30-DK079638, m.b.) und T32HL092332-13, Buchdrucker und m.b., der McNair Medical Foundation (m.b.) und der konfokalen Kern auf das BCM geistigen and Developmental Disabilities Research Center (NIH U54 HD083092 aus dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referenzen
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