マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成
Summary
分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids を表現するインスリンを生成するプロトコルを紹介します。
Abstract
膵臓は、血液グルコースの恒常性と消化を調節する一緒に働く多くの異なったセルタイプから成る複雑な器官です。これらの細胞型には酵素分泌腺房細胞、腸、およびホルモン産生の内分泌細胞に酵素の輸送を担う葉状管システムが含まれます。
内分泌のベータ細胞は、血糖値を下げるインシュリンを作り出すボディの唯一のセル タイプです。糖尿病、損失または β-細胞の障害によって特徴づけられる病気大流行に達しています。したがって、スクリーニング目的のため使用して、薬物および細胞ベースの治療を派生できます β 細胞の開発を調査するためのプロトコルを確立することが不可欠です。マウス開発の実験的調査が不可欠ですが、生体内での研究は手間と時間がかかるです。培養細胞のスクリーニング; もっと便利なプラットフォームを提供します。しかし、彼らは細胞の多様性、建築の組織、および発見した細胞間相互作用を維持することは体内。したがって、膵の形態形成と生理学を調査するための新しいツールの開発が不可欠です。
細胞を整理して複雑な生理学的に有能な大人の臓器に分化膵上皮細胞器官形成の発症から間充織と密接に関連開発します。膵間充織は、多くのよく理解されていません、まだこうして体外培養中に要約することは困難内分泌の開発のための重要な信号を提供します。ここでは、pancreatoids と呼ばれる、間充織を保持文化複雑なマウスの立体化、細胞オルガノイドするプロトコルについて述べる.E10.5 マウス膵芽は解剖、解離、足場のない環境で養殖。浮遊細胞これらは自己開発の pancreatoid と堅牢な内分泌ベータ細胞、腺房と管細胞と一緒に開発数を包み込む間充織と組み合わせてください。このシステムは、器官形成中、や薬物、小さい分子、または遺伝学的スクリーニングの細胞運命決定、構造、形態形成、細胞間の相互作用を研究するために使用できます。
Introduction
正常な発達の生理機構の輪郭を描くは、疾患の病因を理解し、最終的に治療法を育成に重要です。養殖と幹細胞の差別化により、開発を迅速かつ高スループット分析、細胞の運命を制御するメカニズムに関する知識の既存のボディによって制限されます、人工的に開発を繰り返す、比較的均質な二次元の状態1,2。だけでなく、ニッチおよび環境の異なる細胞型と外因性の影響によって影響を受ける生体の開発は器官形成を導くためパラクリン シグナルと組織的支援を提供して、これらの細胞の機能にも依存、ガイダンス3,4、5の周辺。これらの外部の手がかりの重要性、差別化プロトコルの制限およびマウス モデル生体内での骨の折れる性質を考えると、新しいシステムが実験的基本的な発達過程および生理学を調査するため必要です。
3次元、複雑なオルガノイドを生成するプロトコルの出現も病態. 、薬効、生理器官形成研究に便利と合同システムを提供します。6腸胃7などさまざまなシステムが器官形成の私達の理解を拡大しているためマウス オルガノイドの確立、体内よりも少ない制限で発達の複雑性を研究するためのツールを提供します。生体外モデル。形成とひと多能性の出現により幹細胞、ひと腸8、網膜9, 腎10,11, マウス organoid のこれらの進歩のためと脳12オルガノイドを生産されているとこレパートリーは、開発のメカニズムに関する既存の知識によってのみ制限されます。
特定の関心は膵オルガノイドの世代として病気の無数の膵外分泌不全13、膵炎14、腺房細胞の腺房細胞、ダクトを含む種類の異なる膵細胞を悩ませていると糖尿病15のベータ細胞。これらの異なる細胞型の開発に関する知識を得る彼らの病理を理解することに役立つ可能性が、パーソナライズされた薬剤のスクリーニングまたは移植のためのプラットフォームとして使用できます、また。Greggioらが生体の形態形成を要約し、すべての主要な膵上皮細胞から成る組織、立体的で複雑な構造を開発するマウスの膵オルガノイドを作成する手法を開発する以前は、16,17 を種類します。これは膵の分野で主要な前進、体外特にとして作る細胞はベータ細胞の生物学的調査を有効にできます。ただし、内分泌細胞の不足は、ニッチが対話できるし、指導手掛かり17を提供する組織に、オルガノイドを移植しない限り、このプロトコルで結成。間充織が大きく内分泌はく離と分化3,4を含む後の段階に器官形成の初期段階から開発の上皮を包み込む、ニッチの最も大きい部分を構成します。 18。発展途上膵臓と間充織相互作用はまだ器官形成を研究する外因性シグナリングと体内細胞複雑さを維持することの重要性の別の例です。
ここでは、解離の e10.5 マウス膵前駆細胞からの pancreatoids と呼ばれる三次元の膵オルガノイドを生成する方法について述べる。これらの pancreatoids ネイティブ間充織を保持、自己をフローティング状態で組み立てるし、堅牢な内分泌のベータ細胞19数など、主要な膵細胞型をすべて生成します。この方法は、以前のプロトコルは、堅牢な内分泌分化を欠いているように内分泌の開発の分析に最適です。ただし、膵オルガノイドのプロトコルを使用して Greggioらは膵上皮分岐の形態形成解析に適してのとおり分岐と限定 pancreatoids。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞培養モデルの進行は、適切にモデル開発、臨床的に関連する細胞の種類、試験薬の有効性、または患者にも移植を生成に不可欠です。ただし、我々 は器官形成と生理のメカニズムの理解には程遠い、挑戦は皿に開発を人工的にさた体内。こうして体外細胞が効率的に生成された、完全に機能しない、時間の長い期間のために維持されるまたは匹敵する細胞を体内からその他…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
プロトコルおよび原稿に関する有用な議論ありがとう省 Jolanta Chmielowiec。また、ベンジャミン ・ Arenkiel は共焦点顕微鏡へのアクセスに感謝我々。この作品は NIH (P30 – M.B. への DK079638) と T32HL092332-13 M.A.S. と M.B. と (M.B.) にマクネア医療財団、BCM 知的、発達障害研究センターの共焦点のコアによって支えられた (ユニスから NIH U54 HD083092ケネディ ・ シュライバー国立研究所母子保健と人間開発)。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referenzen
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neurowissenschaften. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
