Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten
Summary
Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.
Abstract
Genaue Transkription ist erforderlich für den treuen Ausdruck der genetischen Information. Überraschend allerdings wenig über die Mechanismen, die die Treue der Transkription zu steuern bekannt ist. Um diese Lücke in den wissenschaftlichen Erkenntnissen optimiert wir vor kurzem die Kreis-Sequenzierung Assay um Übertragungsfehler während das Transkriptom des Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis erkennen Elegans. Dieses Protokoll erhalten Forscher mit ein leistungsfähiges neues Tool um die Landschaft der Übertragungsfehler in eukaryontischen Zellen zuzuordnen, so dass die Mechanismen, die die Treue der Transkription Steuern noch nie da gewesenen detailliert aufgeklärt werden können.
Introduction
Das Genom enthält eine genaue biologische Bauplan des Lebens. Um dieses Konzept richtig zu implementieren, ist es wichtig, dass das Genom mit großer Präzision transkribiert werden. Transkription ist jedoch unwahrscheinlich, fehlerfrei zu sein. Z. B. RNA-Polymerasen sind seit langem bekannt, fehleranfällige in-vitro-1,2, und es wurde kürzlich gezeigt, dass sie Fehler in Vivo begehen sowie3,5,6, besonders bei der Konfrontation mit DNA-Schaden7,8,9,10. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass Übertragungsfehler auftreten kontinuierlich in allen lebenden Zellen, was darauf hindeutet, dass sie eine potente Quelle für mutierte Proteine sein könnte.
Dabei bezeichnet transkriptionelle Mutagenese, unterscheidet sich von klassischen Mutagenese in zweierlei Hinsicht. Erstens im Gegensatz zu genetischen Mutationen, Übertragungsfehler mitotische und Post-mitotische Zellen beeinflussen, wie sie DNA-Replikation nicht abhängen. Die Mechanismen, die die Treue der Transkription auswirken wird, daher wertvolle Einblicke in die Mutation Last der mitotischen und Post-mitotischen Zellen bereitstellen. Interessanterweise, Übertragungsfehler haben vor kurzem bei der Förderung von Protein Aggregation11,12,13 in Verbindung gebracht und haben beide Karzinogenese10 Beitrag zur vermutet worden und die Entwicklung der Antibiotika-Resistenz bei Bakterien14.
Zweitens sind im Gegensatz zu genetischen Mutationen, Übertragungsfehler vorübergehend in der Natur. Ihre temporäre Existenz ist besonders anspruchsvoll, da dadurch Übertragungsfehler überaus schwer zu erkennen. Zum Beispiel während verschiedenen Laboren wertvolle Reporter Assays für die Untersuchung der transkriptionellen Mutagenese geplant haben, können diese Tests nur Übertragungsfehler in einer begrenzten Anzahl von Kontexten und Modell Organismen4,15messen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben viele Forscher RNA Sequenzierung Technik (RNA-Seq) verwandelt, die theoretisch Übertragungsfehler während das Transkriptom Art aufgezeichnet werden können. Diese Studien sind jedoch leicht durch Bibliothek Bau Artefakte, z. B. reverse Transkriptionsfehler, PCR-Amplifikation Fehler und die fehleranfällige Art der Sequenzierung selbst verwechselt. Z. B. begehen Reverse Transcriptases etwa ein Fehler jeden ~ 20.000 Basen, während RNA-Polymerasen (RNAPs) nur ein Fehler alle 300.000 Basen5,6machen sollen. Da die Fehlerquote der reversen Transkription allein die Fehlerquote der RNA-Polymerasen in den Zellen Zwerge, ist es praktisch unmöglich, wahre Übertragungsfehler von Artefakten, verursacht durch die Bibliothek Vorbereitung mit traditionellen RNA-Seq-Daten ( zu unterscheiden Abbildung 1a).
Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir eine optimierte Version des Kreis-Sequenzierung (Cirseq oder C-Seq fortan) Assay5,16. Dieser Test ermöglicht dem Benutzer, Übertragungsfehler und andere seltene Varianten in der RNA in die Transkriptom-5zu erkennen. Rundschreiben-Sequenzierung Assay trägt diesen Namen, weil ein wichtiger Schritt in diesem Assay dreht sich um RNA Circularization. Sobald die RNA Ziele circularized sind, sind sie reverse transkribiert in einer rollenden Kreis Mode, lineare DNA-Moleküle zu produzieren, die zahlreiche Kopien der gleichen RNA-Vorlage enthalten. Wenn ein Fehler in einer dieser Vorlagen vorhanden war, würde dieser Fehler auch in jeder einzelnen Wiederholung das DNA-Molekül enthaltenen vorhanden sein. Im Gegensatz dazu Fehler eingeführt durch reverse Transkription, PCR-Amplifikation und Sequenzierung neigen dazu, die zufällig entstehen und werden somit in nur ein oder zwei Wiederholungen. Durch Erzeugung einer Konsensussequenz für jedes DNA-Molekül, und zufällige Fehler von allen wiederholt auftretenden Fehler zu unterscheiden, können so effektiv von wahren Übertragungsfehler (Abbildung 1 b) Bibliothek Bau Artefakte getrennt werden.
Richtig eingesetzt, kann C-Seq-Assay verwendet werden, um genau die Rate der Basis Substitutionen, Einfügungen und Löschungen in RNA in das Transkriptom aller Arten zu erfassen (siehe z. B. Traverse und Ochman17). Beispielsweise haben wir die C-Seq-Assay verwendet, um eine einheitliche Basis Abwicklung5 genomweite Messungen der Fehlerquote der Transkription in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans ermöglichen (unveröffentlichte Beobachtungen). Ursprünglich verwendet, um präzise RNA-Virus Populationen sequenzieren, wurde diese optimierte Version des C-Seq-Assays modernisiert, um zu harte Bedingungen bei der Bibliothek-Vorbereitung zu minimieren, die Bibliothek Bau Artefakte beitragen. Darüber hinaus wird mithilfe einer Anzahl von im Handel erhältlichen Kits der Durchsatz des Assays, sowie die Benutzerfreundlichkeit verbessert. Wenn Sie richtig eingesetzt, kann dieser Assay genau Tausender Übertragungsfehler pro replizieren, dadurch erheblich zu verbessern, auf früheren Studien6erkennen. Insgesamt ist diese Methode bietet ein mächtiges Werkzeug um transkriptioneller Mutagenese studieren und ermöglicht es dem Benutzer, neue Einblicke in die Mechanismen, die die Treue der Transkription in einer Vielzahl von Organismen zu steuern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für die Vorbereitung der C-Seq-Bibliotheken für den Nachweis von Übertragungsfehler in Saccharomyces Cerevisiae, Drosophila Melanogasterund Caenorhabditis Elegans. Dieses Protokoll hat zahlreiche Vorteile gegenüber bestehenden Protokolle sowie alternative Verfahren.
In den letzten 15 Jahren wurden zahlreiche Reporter-Systeme entwickelt, die auf Luciferase7,8 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Publikation möglich wurde durch die Finanzierung von Grant T32ES019851 (zu C. Fritsch), gewähren, R01AG054641 und AFAR junge Ermittler (M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
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