Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas
Summary
Este protocolo ofrece a los investigadores una nueva herramienta para controlar la fidelidad de la transcripción en organismos modelo múltiples.
Abstract
Transcripción exacta es necesaria para la expresión fiel de la información genética. Sorprendentemente sin embargo, poco se sabe sobre los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción. Para llenar este vacío en los conocimientos científicos, hemos optimizado recientemente el análisis de secuenciación del círculo para detectar errores de transcripción en el transcriptoma de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis de elegans de. Este protocolo proporcionará a los investigadores una poderosa nueva herramienta para el paisaje de errores de transcripción en las células eucariotas por lo que los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción pueden ser aclados en detalle sin precedentes.
Introduction
El genoma proporciona un preciso plan biológico de la vida. Para implementar correctamente este anteproyecto, es importante que el genoma se transcribe con gran precisión. Sin embargo, la transcripción es poco probable que sea libre de errores. Por ejemplo, ARN Polimerasas durante mucho tiempo se han sabido para ser propenso en vitro1,2, y fue demostrado recientemente que cometen errores en vivo 3,5,6, así particularmente cuando se enfrenta con ADN daños7,8,9,10. Tomados en conjunto, estas observaciones indican que errores de transcripción se producen continuamente en todas las células vivas, sugiriendo que podría ser una fuente potente de proteínas mutadas.
Este proceso, llamado mutagénesis transcripcional, difiere de la mutagénesis clásica de dos maneras. En primer lugar, en contraste con las mutaciones genéticas, errores de transcripción afectan las células mitotic y poste-mitotic, como no dependen de la replicación del ADN. Estudio de los mecanismos que afectan a la fidelidad de la transcripción, por lo tanto, proporcionará información valiosa sobre la carga de mutación de las células mitotic y poste-mitotic. Curiosamente, errores de transcripción recientemente han sido implicados en la promoción de la agregación de proteína11,12,13 y presumidos para contribuir a ambas de la carcinogénesis10 y el desarrollo de resistencia antibiótica en bacterias14.
En segundo lugar, en contraste con las mutaciones genéticas, errores de transcripción son transitorias en la naturaleza. Su existencia temporal es particularmente desafiante ya que hace sumamente difícil detectar errores de transcripción. Por ejemplo, mientras que varios laboratorios han ideado ensayos reportero valiosa para el estudio de mutagénesis transcripcional, estos ensayos sólo son capaces de medir los errores de transcripción en un número limitado de contextos y modelo organismos4,15. Para superar estas limitaciones, muchos investigadores han recurrido a la tecnología de la secuenciación del RNA (RNA-seq), que teóricamente permite errores de transcripción que se registrará en el transcriptoma de cualquier especie. Sin embargo, estos estudios son fácilmente confundidos por artefactos de construcción de biblioteca, tales como errores de transcripción inversa, PCR amplificación errores y lo errores de la secuencia sí mismo. Por ejemplo, reverso transcriptasas cometer un error de aproximadamente cada bases ~ 20.000, mientras que ARN Polimerasas (RNAPs) se esperan que sólo un error cada 300.000 bases5,6. Porque la tasa de error de transcripción reversa solo empequeñece la tasa de error de Polimerasas del RNA dentro de las células, es prácticamente imposible distinguir entre errores de transcripción verdadero artefactos causados por la preparación de la biblioteca en datos tradicionales de RNA-Seq ( Figura 1a).
Para resolver este problema, hemos desarrollado una versión optimizada de la secuenciación del círculo (Cirseq, o C-seq en adelante) ensayo5,16. Este ensayo permite detectar errores de transcripción y otras variantes raras en RNA en el transcriptoma5. El análisis de secuencia circular lleva este nombre porque un paso clave en este ensayo gira en torno a circularización de RNA. Una vez que los objetivos de RNA son circular, son revés transcrito de manera círculo rodante, para producir moléculas de cDNA lineal que contienen numerosas copias de la misma plantilla del RNA. Si un error estuvo presente en una de estas plantillas, este error también estaría presente en cada repetición única dentro de la molécula de cDNA. En cambio, errores introducidos por transcripción reversa y amplificación por PCR secuenciación tienden a surgir al azar y así estará presentes en sólo una o dos repeticiones. Por lo tanto, generando una secuencia de consenso para cada molécula de ADNc y distinguir errores aleatorios de los errores que se producen en todas las repeticiones, artefactos de construcción de biblioteca con eficacia pueden ser separados de los errores de transcripción verdadera (Figura 1b).
Si se utiliza correctamente, puede utilizarse el ensayo C-seq para detectar con precisión la tasa de base sustituciones, inserciones y eliminaciones en el ARN en el transcriptoma de cualquier especie (por ejemplo, véase travesía y Ochman17). Por ejemplo, hemos utilizado el ensayo C-seq para proporcionar mediciones de todo el genoma de la tasa de error de transcripción en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis elegans con una única resolución base5 (inéditas observaciones). Originalmente utilizado para exactamente la secuencia de las poblaciones de virus de ARN, esta versión optimizada del ensayo C-seq ha racionalizado para reducir al mínimo las agresiones durante la preparación de la biblioteca que contribuyen a los artefactos de construcción de biblioteca. Además, mediante el uso de un número de kits disponibles en el mercado, el rendimiento de la prueba se mejora, así como su facilidad de uso. Si se usa correctamente, este análisis pueden detectar con precisión miles de errores de transcripción por repetición, de tal modo grandemente mejorando en anteriores estudios6. En general, este método proporciona una poderosa herramienta para el estudio de mutagénesis transcripcional y permitirá al usuario obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción en una amplia gama de organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un protocolo optimizado para la elaboración de bibliotecas de C-seq para la detección de errores de transcripción en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis elegans. Este protocolo tiene numerosas ventajas sobre los protocolos existentes, así como técnicas alternativas.
En los últimos 15 años, numerosos reportero han desarrollado sistemas que dependen de luciferase7,<sup class="xre…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta publicación fue hecha posible por el financiamiento del grant T32ES019851 (para C. Fritsch), R01AG054641 y un investigador joven AFAR conceden (a M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
Referenzen
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