Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti
Summary
Questo protocollo fornisce ai ricercatori con un nuovo strumento per monitorare la fedeltà della trascrizione in molteplici organismi di modello.
Abstract
Trascrizione accurata è necessaria per la fedele espressione dell’informazione genetica. Sorprendentemente, però, piccolo è conosciuto circa i meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione. Per colmare questa lacuna nella conoscenza scientifica, abbiamo recentemente ottimizzato il dosaggio di cerchio-sequenziamento per rilevare errori di trascrizione in tutto il trascrittoma di Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Questo protocollo di fornire ai ricercatori con un nuovo potente strumento per mappare il paesaggio di errori di trascrizione nelle cellule eucariotiche, in modo che i meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione possono essere chiariti in dettaglio senza precedenti.
Introduction
Il genoma fornisce un preciso progetto biologico della vita. Per implementare correttamente questo programma d’azione, è importante per il genoma deve essere trascritto per primo con grande precisione. Tuttavia, la trascrizione è improbabile che sia privo di errori. Ad esempio, RNA polimerasi lungamente sono state conosciute per essere soggetta a errori in vitro1,2, e recentemente è stato indicato che commettono errori in vivo come pure3,5,6, specialmente quando si confronta con DNA danni7,8,9,10. Prese insieme, queste osservazioni indicano che gli errori di trascrizione avviene con continuità in tutte le cellule viventi, suggerendo che potrebbe essere una potente fonte di proteine mutate.
Questo processo, chiamato mutagenesi trascrizionale, differisce dal classica mutagenesi in due modi. In primo luogo, in contrasto con le mutazioni genetiche, gli errori di trascrizione interessano sia in cellule post-mitotiche che mitotiche, come essi non dipendono dalla replicazione del DNA. Lo studio dei meccanismi che influenzano la fedeltà della trascrizione, pertanto, fornirà informazioni preziose sul carico mutazione di cellule post-mitotiche e mitotiche. È interessante notare che, gli errori di trascrizione recentemente sono stati implicati nella promozione di proteina aggregazione11,12,13 e sono stati supposti per contribuire a entrambi di carcinogenesi10 e la sviluppo di resistenza agli antibiotico nei batteri14.
In secondo luogo, in contrasto con le mutazioni genetiche, gli errori di trascrizione sono natura transitori. Loro esistenza temporanea è particolarmente impegnativo, perché rende gli errori di trascrizione estremamente difficile da rilevare. Ad esempio, mentre diversi laboratori hanno messo a punto saggi reporter prezioso per lo studio di mutagenesi trascrizionale, queste analisi sono solo in grado di misurare gli errori di trascrizione in un numero limitato di contesti e organismi modello4,15. Per superare queste limitazioni, molti ricercatori si sono rivolti a tecnologia di sequenziamento di RNA (RNA-seq), che permette teoricamente gli errori di trascrizione da registrare in tutto il trascrittoma di qualsiasi specie. Tuttavia, questi studi sono facilmente confusi dai manufatti di costruzione di libreria, quali errori di trascrizione inversa, errori di amplificazione di PCR e la natura soggetta a errori di impostazione della sequenza stessa. Per esempio, reverse transcriptases commit circa un errore ogni ~ 20.000 basi, mentre la RNA polimerasi (RNAPs) sono tenute a compiere un solo errore ogni 300.000 basi5,6. Poiché il tasso di errore di trascrizione d’inversione da solo nani il tasso di errore della polimerasi del RNA all’interno delle cellule, è praticamente impossibile distinguere gli errori di trascrizione vera da artefatti causati dalla preparazione libreria in dati di RNA-Seq tradizionali ( Figura 1a).
Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una versione ottimizzata del cerchio-sequenziamento (Cirseq, o C-seq d’ora in poi) dosaggio5,16. Questo test consente di rilevare gli errori di trascrizione e altre rare varianti nel RNA in tutto il trascrittoma5. L’analisi di sequenziamento circolare porta questo nome perché un passo fondamentale in questa analisi ruota intorno circularization di RNA. Una volta che gli obiettivi del RNA sono circolarizzazione, sono inverso trascritto in una rotolamento cerchio moda, per produrre molecole di cDNA lineare che contengono numerose copie dello stesso modello di RNA. Se un errore era presente in uno di questi modelli, questo errore potrebbe anche essere presente in ogni singola ripetizione contenute all’interno della molecola di cDNA. Al contrario, gli errori introdotti dal trascrizione inversa, amplificazione di PCR o sequenziamento tendono a verificarsi in modo casuale e così sarà presenti in solo uno o due ripetizioni. Così, generando una sequenza di consenso per ogni molecola di cDNA e distinguere errori casuali da errori che si verificano in tutte le ripetizioni, manufatti di costruzione di libreria possono essere separati in modo efficace da errori di trascrizione vera (Figura 1b).
Se usato correttamente, il dosaggio di C-seq può essere utilizzato per rilevare con precisione il tasso di base sostituzioni, inserimenti ed eliminazioni in RNA in tutto il trascrittoma di qualsiasi specie (ad esempio, Vedi Traverse e Ochman17). Ad esempio, abbiamo usato il test C-seq per fornire misurazioni di genoma del tasso di errore di trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans con una sola risoluzione base5 (osservazioni non pubblicate). Originariamente utilizzato per accuratamente sequenza RNA virus popolazioni, questa versione ottimizzata del dosaggio C-seq è stata semplificata per minimizzare condizioni difficili durante la preparazione di libreria che contribuiscono agli elementi di costruzione di libreria. Inoltre, utilizzando una serie di kit disponibili in commercio, la velocità effettiva del dosaggio è notevolmente migliorata, così come la facilità d’uso. Se usato correttamente, questo test è in grado di rilevare con precisione migliaia di errori di trascrizione per replica, migliorando così notevolmente il precedente studi6. Nel complesso, questo metodo fornisce un potente strumento per lo studio di mutagenesi trascrizionale e permetterà all’utente di acquisire nuove conoscenze sui meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione in una vasta gamma di organismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la preparazione delle librerie C-seq per il rilevamento di errori di trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Questo protocollo ha numerosi vantaggi rispetto ai protocolli esistenti, come pure le tecniche alternative.
Negli ultimi 15 anni, sono stati sviluppati numerosi sistemi reporter che si basano su luciferase7,8…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa pubblicazione è stata resa possibile dai finanziamenti da parte di grant T32ES019851 (a C. Fritsch), R01AG054641 e un ricercatore giovane AFAR concedere (Vermulst M.).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
Referenzen
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