真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視
Summary
このプロトコルは、複数のモデル生物における転写の忠実度を監視する新しいツールと研究者を提供します。
Abstract
正確な表記は、遺伝情報の忠実な表現に必要です。しかし意外にも、少しは転写の忠実度を制御するメカニズムについて知られています。科学の知識で、このギャップを埋めるためには、我々 は最近線虫、ショウジョウバエ、酵母のトランスクリプトームを通して転写エラーを検出するサークル シーケンス分析を最適化線虫。このプロトコルは、前例のない詳細の転写の忠実度を制御するメカニズムを解明することができますので、真核細胞での転写エラーの風景にマップする強力な新しいツールを使って研究を提供します。
Introduction
ゲノムは生命の正確な生物の設計図を提供します。この青写真を正しく実装するには、素晴らしい精度で転写されるゲノムのために重要です。ただし、転写は、エラーが発生する可能性がありますはありません。たとえば、RNA ポリメラーゼがエラーを起こしやすい体外1、2、長い知られている、最近エラー体内だけでなく、3、5,6、犯すことが示されました。特に、DNA 損傷7,8,9,10に直面しています。一緒に取られて、これらの観察は、転写エラー発生する継続的にすべての生きた細胞でタンパク質構造変異の強力なソース可能性があることを示唆していることを示します。
転写変異と呼ばれるこのプロセスは、2 つの方法で古典的な変異によって異なります。最初に、彼らは DNA の複製に依存しない、遺伝子の突然変異とは対照的転写エラーは分裂期と分裂後の細胞を影響します。転写の忠実度に影響を与えるメカニズムを勉強して、したがって、分裂、分裂後の細胞の突然変異荷重に対して貴重な洞察を提供します。興味深いことに、転写エラーが最近タンパク質凝集11,12,13のプロモーションに関与しているし、10両の発癌に寄与するように仮定されたが、細菌14の抗生の抵抗の開発。
第二に、遺伝子の突然変異と対照をなして転写エラー、自然で一時的です。転写エラーを検出するため極めて困難になりますので、彼らの一時的な存在は特に挑戦的です。たとえば、いくつかのラボは、転写の突然変異誘発の研究のための貴重な記者アッセイを考案した、一方これらの試、コンテキストとモデル生物4,15の限られた数の転写エラーを測定することができるのみ。これらの制限を克服するために多くの研究者は、理論により、任意の種のトランスクリプトームを通して記録される転写エラー RNA 塩基配列決定技術 (RNA シーケンス) になっています。ただし、これらの研究は、逆のトランスクリプション エラー、PCR 増幅エラー シーケンス自体のエラーを起こしやすい性質など、図書館建設の成果物によって簡単に混同されます。たとえば、逆転写酵素約 1 つのエラーすべて 〜 20,000 拠点間コミット RNA ポリメラーゼ (RNAPs) は、1 つだけエラーをすべて 300,000 拠点5,6にすると予想されます。従来の RNA シーケンス データ (ライブラリ準備で起因するアーチファクトと真転写エラーを区別することは事実上不可能じゃないので単独で逆のトランスクリプションの誤り率を小さく細胞内 RNA ポリメラーゼのエラー率、図 1 a)。
この問題を解決するために試金5,16円シーケンス (Cirseq、または今後 C seq) の最適化されたバージョンを行った。このアッセイでは、トランスクリプトーム5で RNA の転写エラー、その他の稀な変形を検出することができます。円形配列アッセイは、この試金の重要なステップは、環状 RNA を中心に展開するためにこの名前を運ぶ。RNA ターゲットが円形、一度彼らは同じ RNA テンプレートの数多くのコピーを含む線形 cDNA 分子を生成する、ローリング サークル ファッションを転写したリバースされます。エラーは、これらのテンプレートの 1 つには、このエラーは cDNA 分子内に含まれるすべての単一の繰り返しで現在もでしょう。対照的に、逆のトランスクリプション、PCR 増幅、またはシーケンスによって導入されたエラーはランダムに発生する傾向がある、こうして繰り返されるがのみ 1 つまたは 2 つがあります。したがって、各 cDNA 分子コンセンサス シーケンスを生成してランダム エラーを区別するすべての繰り返しで発生するエラーで、ライブラリ構築アーティファクト効果的にから分離できる真の転写エラー (図 1 b)。
任意の種のトランスクリプトームで RNA の塩基置換、挿入、および削除の速度を正確に検出 C seq 試金を使用することができます適切に使用する場合 (たとえば、トラバース ・ オフマン17を参照)。たとえば、我々 は単一の基本解像度は、5 と酵母、ショウジョウバエ、線虫で転写の誤り率のゲノム全体の測定値を提供するために C seq 試金を使用しています。(未発表の観察)。最初に正確に RNA ウイルス集団をシーケンスに使用、C seq 試金のこの最適化されたバージョンがライブラリ構築アーティファクトに貢献するライブラリの準備中に過酷な条件を最小限に抑えるために合理化されています。さらに、市販のキットの数を使用して、アッセイのスループットが大幅に向上、その使いやすさだけでなく、適切に使用する場合、この試金は正確にあたり、大幅改善前の研究6転写エラーの何千もを検出できます。全体的にみて、このメソッドは転写変異を研究する強力なツールを提供、幅広い生物の転写の忠実度を制御するメカニズムに新しい洞察力を得るためにユーザーになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、酵母、ショウジョウバエ、線虫で転写エラーの検出のための C seq ライブラリの準備のための最適化されたプロトコルについて述べる。このプロトコルには、代替技術と同様に、既存のプロトコルでは、多くの利点があります。
過去 15 年間、レポーターの多数のシステム開発されているルシフェラーゼ7,<sup class="xr…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この文書は、(C. フリッチュ) に助成金 T32ES019851 からの資金によって可能になった、R01AG054641 と遠く若手研究者は (M. Vermulst) に付与します。
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
Referenzen
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
