Aislamiento y la incorporación de recolección de luz las antenas de la diatomea Cyclotella Meneghiniana en liposomas con lípidos de tilacoides
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar fucoxantina clorofila/c proteínas de unión (FCP) de diatomeas y los incorpore a liposomas con composiciones de lípidos naturales para el estudio de transferencia de energía de excitación a cambios en la composición de iones.
Abstract
El desempeño fotosintético de las plantas, algas y diatomeas depende en la regulación rápida y eficiente de la luz cosecha energía y procesos de transferencia en la membrana de los tilacoides de los cloroplastos. Transferencia eficiente a la reacción fotosintética centros así como en cuanto a la fotoprotección de la luz excesiva y la luz cosecha antena de diatomeas, el llamado fucoxantina clorofila/c proteínas de unión (FCP), son necesarios para la absorción de la luz. El interruptor entre estas dos funciones es una cuestión de muchos años de investigación. Muchos de estos estudios se llevan a con FCP en micelas de detergente. Estudios de interacción, se han eliminado los detergentes, que condujo a una agregación inespecífica de los complejos FCP. En este enfoque, es difícil discriminar entre artefactos y datos fisiológicamente relevantes. Por lo tanto, puede obtenerse información más valiosa acerca de la FCP y otra luz de membrana destino cosecha complejos mediante el estudio de las interacciones proteína-proteína, transferencia de energía y otras características espectroscópicas si están integrados en su entorno nativo del lípido. La principal ventaja es que los liposomas tienen un tamaño definido y una proporción de lípidos/proteínas definidas por el cual se controla el grado de clustering de FCP. Además, fácilmente se pueden simular cambios en la composición de pH y de iones que regulan la luz en vivo . En comparación con la membrana de los tilacoides, los liposomas son más homogénea y menos compleja, que resulta más fácil obtener y entender datos espectroscópicos. El protocolo describe el procedimiento de aislamiento de FCP, purificación, preparación de liposomas e incorporación de FCP en liposomas con composición lipídica natural. Resulta de una aplicación típica se da y se discuten.
Introduction
Organismos fotosintéticos tales como diatomeas deben lidiar con condiciones de luz cambiantes y responder con mecanismos sofisticados de aclimatación que mantener alta eficiencia fotosintética y protegen de daño foto-oxidativo causado por la luz excesiva. Un importante proceso de luz protectora en eucariotas fotosintéticos es la alta energía amortiguamiento (qE) de la luz absorbida que se presenta como la principal contribución a la Temple no fotoquímica (NPQ) bajo condiciones de estrés ligero1,2 ,3. Los complejos antena cosecha luz (LHC) están implicados en la regulación de vías de transferencia de energía de excitación. En respuesta a la luz alta inducida por el bajo pH en el lumen del cloroplasto, los interruptores del sistema de antena de la cosecha de estado al estado apagando la luz. Este estado disipativo de energía protege fotosistemas (PS) y otros complejos en la membrana del thylakoid de la foto-oxidación. En eucariotas fotosintéticos, qE es generalmente inducida por dos factores1,2,3. Un factor es la luz especializada recolección proteína que responde a bajo pH. La proteína subsidiarios induce la qE en las plantas superiores4. LhcSRs5, modulado por la actividad de subsidiarios, inducir la qE en algas verdes6. Las diatomeas poseen Lhcx-como proteínas relacionadas estructuralmente con LHCSRs7,8,9,10.
El segundo factor de qE es el ciclo de la xantofila donde los carotenoides de la antena son convertidos en forma de foto protección de-epoxidación y revertidos por epoxidación. En plantas y algas verdes, violaxantina se convierte en zeaxantina. En diatomeas, diadinoxanthin se convierte en diatoxanthin, que luego se correlaciona con el grado de NPQ11. La luz de la diatomea cosecha antena posee algunas peculiaridades aunque es evolutivo relacionado con plantas y algas LHCs. El interruptor de la luz cosecha a fotoprotección es enormemente rápido y la capacidad NPQ es superior comparada con las plantas12. Esta podría ser una razón por la cual las diatomeas muy exitosas en diferentes nichos ecológicos de manera que son responsables de hasta un 45% de la producción primaria neta oceánico13. Por lo tanto, luz cosecha sistemas de diatomeas son un interesante objeto de investigación de la fotosíntesis.
Diatomeas, como las centradas en especies de Cyclotella meneghiniana, poseen tilacoides luz intrínseca cosecha sistemas nombrados después de los pigmentos unen – fucoxantina, clorofila (chl) a y c, por lo tanto luz FCP. recolección de proteínas, como la FCPs, son incrustado en el sistema de membranas de tilacoides que comprende varias capas de membrana. Las diatomeas forman bandas de tres tilacoides. Este complejo situación dificulta estudiar en el nivel molecular en la membrana de los tilacoides. Además, muchos componentes contribuyen a la regulación de la luz cosecha (véase arriba). Por lo tanto, en muchos enfoques, los complejos fueron aislados de la membrana usando detergentes suaves, tales como n-dodecil-β-D-maltopyranoside (β-DDM), que solubilizan la membrana pero mantener intacto los complejos FCP. Se realizaron muchos estudios espectroscópicos uso FCP solubilizado para investigar energía intramolecular transferencia14,15,16,17. Sin embargo, este enfoque anterior era limitada ya que la regulación de la transferencia de energía necesita interacción excitonic con otros complejos de antena o fotosistemas. Por lo tanto, este tipo de estudios no se puede realizar con complejos solubles debido a la interacción entre complejos se pierde.
Una característica importante en la regulación de la antena es la “apretadura molecular” de la antena y fotosistemas en la membrana tilacoides del18. Anteriormente, se llevó a cabo un enfoque simple para simular este efecto en vitro. El detergente fue quitado, que conduce a la agregación aleatoria de complejos antena. Aunque se obtuvieron algunos datos razonables por este enfoque17,19, detergente no refleja la situación en vivo y tiene algunas limitaciones ya que los complejos no están interactuando en los terciarios regulares estructura.
El uso de liposomas supera varias de las limitaciones anteriores. La estructura terciaria sigue siendo totalmente intacta. La membrana del liposoma proporciona un entorno cuasi-nativo para los complejos de antena. La membrana separa el interior de la liposoma del ambiente exterior. Por estos medios, liposomas proporcionan dos compartimientos de la reacción para estudios de gradientes de iones y pH, así como por procesos de transporte. Además, pueden controlarse más fácilmente los parámetros del sistema experimental de estudios de la membrana del thylakoid. Liposomas ya fueron demostrados para ser una excelente herramienta para el estudio de complejos fotosintéticos. Un enfoque principal en el pasado fue en la planta donde se probó el efecto de la composición lipídica alterada en LHC II20LHC. En otros enfoques, interacción de la proteína-proteína entre diferentes LHC II fueron investigados21. También, algunos en algas verdes se realizaron estudios que describen la agrupación espontánea entre el LHC22. Considerando la importancia de las diatomeas para los ecosistemas acuáticos, relativamente pocos estudios se realizaron con los complejos antena de diatomeas. Dos estudios investigaron los complejos antena de la centrada en la Cyclotella meneghiniana, donde se muestra el agrupamiento de la FCP antena23 y capacidad de respuesta de FCP a gradientes electroquímicos24 . Así, los liposomas son una excelente herramienta para el estudio de diatomeas antenas y su interacción y regulación en condiciones casi nativas. Los liposomas son versátiles desde muchas condiciones tales como la composición de lípido, liposomas tamaño, densidad de la proteína y la fase acuosa circundante puede ser controlada. Además, el método requiere pequeñas cantidades de muestras. El sistema experimental es robusto y altamente reproducibles. Permite la compartimentalización de liposomas para el estudio de pH y los gradientes de iones, que son importantes factores en la regulación de los complejos antena.
Aquí, describimos el aislamiento de complejos de antena FCP de C. meneghiniana y su incorporación en los liposomas con composición de lípido natural tilacoides. También, proporcionamos datos ejemplares para la caracterización espectroscópica de FCP solubilizado y compararlos con FCP en liposomas. El método resume conocimientos y protocolos estandarizados de las mejoras de Gundermann y Büchel 201223, Natali et al 201622y Ahmad y Dietzel 201724.
Figura 1: representación esquemática del flujo de trabajo. (1) se refiere al párrafo 1 que describe el crecimiento celular, desorganización y aislamiento de tilacoides con la siguiente separación de FCP en gradientes de densidad de sacarosa; M. C. -Células deCyclotella meneghiniana . (2) preparación de la mezcla de lípidos naturales tilacoides (MGDG, DGDG y SQDG) había descrito en el párrafo 2 y creación de micelas de detergente de lípidos con octylglycoside (OG). Se consigue un tamaño de micela de lípidos definidos por extrusión utilizando membranas de diámetro de poro definido. FCP y lípido micelas se unifican en un lípido predefinido: relación y los detergentes OG y β-DDM son quitado vía controlado diálisis formando proteoliposomes FCP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Liposomas FCP con la composición de lípido natural proporcionan una herramienta práctica, simple y reproducible para investigar propiedades espectroscópicas in vitro. El medio lipídico en liposomas FCP se asemeja a la situación dentro de la membrana del thylakoid, dando lugar a resultados experimentales que están más cercanos de las condiciones naturales.
Hay varias ventajas de utilizar meneghiniana C. como sistema modelo para antena FCP. Crece relativamente rápido y…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Rana Adeel Ahmad para ayuda en la purificación de la FCP. Prof. Claudia Büchel se reconoce para las discusiones útiles y leyendo el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Fundación alemana de investigación de LD (DI1956-1/1) y la Fundación Humboldt para una Beca Feodor Lynen para ld
Materials
| 500 ml centrifuge vials | |||
| high speed centrifuge | Heraeus | ||
| Bead Mill VI 2 | Edmund-Bühler (edmund-buehler.de) | newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 µm | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| VitraPOR filter funnel – por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
| Ultracentrifuge Discovery 90SE | Sorvall | n.a. | |
| rotor T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| Neubauer Cell Counter Chamber (improved) | Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) | T729.1 | |
| Zeiss Mikroskop Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| optical glass cuvettes (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| rotor AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
| Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff | Millipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad (bio-rad.com) | 1610449 | |
| libre office spread sheet | The document foundation | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| special glass cuvettes for fluorescence (101-0S) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software) | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
| SDS-loading buffer Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-octyl β-D-glucopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | make stock solution in chloroform |
| Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | make stock solution in chloroform |
| Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | make stock solution in chloroform |
| L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | make stock solution in chloroform |
| L-α-Phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | make stock solution in chloroform |
| sonicator bath S-50TH | Sonicor (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | |
| mini-Extruder | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610000 | |
| Nuleopore polycarbonate membrane | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
| dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | boil in destilled water before use |
| Biobeads SM2 Adsorbent | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
| sucrose epichlorhydrin copolymer – Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
| Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
| rotor TFT 80.4 | Millipore (merckmillipore.com) | 54356 | |
| material listed in order of appearance | |||
| For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals. | |||
| Standard lab material and substances are not listed. |
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