O objetivo do presente protocolo é medir o tempo de trânsito de fluorescente etiquetado alimento através do intestino de zebrafish larval de forma alto throughput.
Zebrafish são utilizados como organismos modelo alternativo para testes de segurança de drogas. O trato gastrointestinal (GI) de zebrafish tem semelhanças genéticas, neuronais e farmacológicas dos mamíferos. SOLDADO intolerância durante os testes clínicos de candidatos da droga é comum e pode representar uma séria ameaça para a saúde humana. Ensaios de toxicidade de GI em modelos pré-clínicos de mamíferos podem ser caro em termos de tempo, composto de teste e mão de obra. O método de alto rendimento apresentado aqui pode ser usado para prever a GI questões de segurança. Comparado aos modelos de mamíferos, este método permite a avaliação mais exaustivo dos efeitos compostos de teste no trânsito GI enquanto estiver usando baixas quantidades de composto. Neste método, o zebrafish larval (7 dias após a fecundação) são alimentados com alimentos contendo uma etiqueta fluorescente. Após a alimentação, cada peixe larval é colocado em um poço de uma placa de 96-cónico-fundo-bem e dosado com composto de teste (dissolvido em água) ou o veículo. Como ocorre o trânsito do intestino, matéria fecal se acumula no fundo dos poços, e a taxa na qual isto acontece é monitorizada pela medição de fluorescência do fundo do poço repetidamente ao longo do tempo usando um Espectrofotômetro de placa. A fluorescência de larvas em um grupo determinado de tratamento são média e esses valores são graficamente juntamente com o erro-padrão, para cada tempo de medição, produzindo uma curva que representa a médio trânsito dos alimentos ao longo do tempo. Efeitos sobre o tempo de trânsito do intestino são identificados, comparando a área sob a curva para cada grupo de tratamento para que do grupo tratados com veículo. Esse método detectou alterações no tempo de trânsito GI zebrafish induzido por drogas com efeitos clínicos conhecidos de GI; pode ser empregado para interrogar dezenas de tratamentos para efeitos GI por dia. Como tal, compostos mais seguros podem ser rapidamente priorizados para testes dos mamíferos, que acelera a descoberta e profere avanço dos 3R.
Peixe-zebra (Danio rerio) são usados para modelar a biologia vertebrada e prever a toxicidade de drogas e/ou eficácia; novas aplicações nestes campos surgem a cada ano. As vantagens do zebrafish em modelos mamíferos incluem sua fecundidade, tamanho pequeno e transparência através da organogênese. Zebrafish são usados para prever a droga candidato toxicidade aguda, também como para avaliar o impacto de composto na função do órgão, por exemplo, cardíaco, ocular, gastrointestinais (GI)1,2. Fisiologia e desenvolvimento Zebrafish são semelhantes dos mamíferos em muitas maneiras3 e 80% dos genes que estão associados com doenças humanas têm um zebrafish do homólogo4.
O trato Gastrintestinal do zebrafish tem fisiologia semelhante para o trato gastrointestinal dos mamíferos, mas tem um mais simples arquitetura5. Zebrafish não têm estômago; o bulbo intestinal anterior atua como um depósito de alimentos. Expressão gênica em zebrafish intestino tem muitas semelhanças com isso do mamífero5. Como mamíferos, o sistema nervoso entérico do zebrafish controla a motilidade do intestino, e inervação intestinal espelhos de outros vertebrados6,7. Com base em semelhanças, distúrbios funcionais do intestino humano têm sido estudados em zebrafish, usando métodos derivados de modelos mamíferos8.
SOLDADO intolerância durante os testes clínicos de candidatos da droga é comum e pode representar uma séria ameaça para a saúde humana. Uma revisão de programas em uma grande empresa farmacêutica durante 2005 – 2010 revelou GI segurança como a principal causa para 9% do estudo clínico terminações9. Ensaios de toxicidade de GI em modelos pré-clínicos de mamíferos podem ser caro em termos de tempo, composto e trabalhista. Um ensaio de alta produtividade preditivo para trânsito GI pode fornecer flexibilidade para testes de toxicidade de compostos e produzir impacto dos 3R. Um método novo, oferecendo tal um ensaio é apresentado pelo protocolo descrito neste documento. Este ensaio de alto rendimento pode ser empregado no início do desenvolvimento de drogas para priorizar os candidatos e contribuir para a redução de GI segurança testes em espécies maiores.
O método de espectrofotometria de romance para medir o tempo de trânsito de zebrafish de GI larvas, apresentado aqui, é um ensaio eficiente que pode prever os efeitos do tratamento sobre mamíferos GI-função. Embora o ensaio tem baixa sensibilidade, ele tem alta previsibilidade positiva, que é aceitável para primeira camada ensaios empregados para enxugamento do número de tratamentos de candidato baseado em toxicidade12. Este método é mais fácil de executar, tem uma taxa de transferência e usa menos animal manipulação etapas do que a microscopia fluorescente.
Existem desafios técnicos inerentes a este método. Captura de larvas individuais depois de alimentar o fluorescente e transferi-las para poços individuais é difícil no começo. No entanto, com a prática, um técnico especializado pode preencher uma placa de 96 poços em menos de 15 min. Se, em um ponto determinado do tempo, a placa é acidentalmente abalada e a matéria fecal inquietos do fundo dos poços antes da leitura, a acumulação aparecerá para diminuir. Isto pode ser evitado, movendo as placas cuidadosamente, sem tremer. Em nossa experiência, movimento normal, incluindo o de gaveta motorizado de Espectrofotômetro de placa, não perturbou o ensaio. Leitores, equipados com um aquecedor da placa (isto é, a placa não tem de ser devolvida a incubadora entre medições) e localizado perto de ensaio banco de laboratório pode otimizar para menor chance de perturbação, mas isso não era necessário em nossa experiência.
Tentativas iniciais do método não inclui alimentação nos dias antes do ensaio. Sem aqueles feedings ‘prática’, menor número de larvas consumido alimentos fluorescente suficiente durante o tempo permitido antes da aplicação do tratamento. Essas tentativas, variação dentro dos grupos de tratamento foi maior, e mais dados estavam inutilizáveis devido a baixa/não sinal acumulação ao longo do tempo. Mesmo com a prática de alimentação, algumas larvas não consumir quantidades suficientes de alimentos fluorescente, excluindo dados dessas larvas diminui a variação dentro dos grupos e aumenta a capacidade de identificar os efeitos do tratamento. Começando com tamanhos maiores do grupo (ou seja, 24 contra 12) permite que um número suficiente de larvas contribuindo dados úteis para a análise.
A microscopia fluorescente revela que o trânsito de alimentos foi quase completo por 24h em larvas tratados com atropina (não mostrado), no entanto, os dados de microplacas do ponto final de tempo refletem sinal final inferior no grupo de atropina, comparado ao grupo de veículo. Por outro lado, maior fluorescência de microplacas final foi associada com tratamentos que acelerou o tempo de trânsito, mesmo que as larvas tratados com veículo aparentemente tem anulado seu trato gastrointestinal antes do ponto final do tempo. Com base na atribuição aleatória para tratamento de larvas deu comida fluorescente, assumimos consumo equivalente do alimento fluorescente, em média, entre os grupos de tratamento. Dado isto e com base em padrões descritos acima, a fluorescência de matéria fecal declina com o tempo gasto no trato GI larval ou trânsito rápido adiciona fluorescência para as fezes de alguma forma. A causa é desconhecida e não tem sido interrogada, no entanto, o ensaio ainda é capaz de medir e comparar o tempo de trânsito entre os grupos.
O emprego desse método na detecção de efeitos tóxicos do GI de pequena molécula compostos é uma aplicação. Outras aplicações possíveis incluem modelagem de doença (por exemplo, síndrome do intestino irritável) e descoberta de romance terapia para tais doenças, ou para descobrir compostos pro-cinético. Além disso, juntamente com modelos transgénicos, esse método pode ser usado para interrogar o papel dos genes no trânsito de GI normal, bem como transtornos de trânsito, incluindo deficiência de neurônios entéricos. A larva de zebrafish oferece uma plataforma de todo organismo em uma escala que se aproxima a de cultivo celular, mas uma vez que existem vários tecidos e tipos de inumeráveis células funcionando juntos no zebrafish, perguntas de biologia de sistemas podem ser perguntadas e responderam a usando este modelo.
Com os avanços na tecnologia, novas aplicações e respectivas, a eficiência na realização de ensaios de toxicidade de zebrafish vai continuar a melhorar. Zebrafish larval manipulação métodos e ensaios estão continuando a melhorar em termos de maior taxa de transferência13,14. O novo método apresentado aqui é um exemplo de uma melhoria que pode fazer estudos de zebrafish mais impactante.
The authors have nothing to disclose.
Simon Cassar de carpetbones.com projetado e criado a figura animada usada para demonstrar o procedimento na vida do ensaio do trânsito GI.
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |