El objetivo de este protocolo es medir el tiempo de tránsito de fluorescencia etiquetada alimentos a través del intestino del pez cebra larval en forma de alto rendimiento.
Pez cebra se utilizan como organismos modelo alternativo para pruebas de seguridad de drogas. El tracto gastrointestinal (GI) de pez cebra tiene similitudes genéticas, neuronales y farmacológicas a la de los mamíferos. Intolerancia GI durante ensayos clínicos de medicamentos es común y puede representar una grave amenaza para la salud humana. Pruebas de toxicidad gastrointestinal en modelos preclínicos de mamíferos pueden ser costosos en términos de tiempo, sustancia de ensayo y trabajo. El método de alto rendimiento presentado aquí puede utilizarse para predecir los problemas de seguridad GI. Comparado con modelos mamíferos, este método permite la evaluación más conveniente de prueba compuesto efectos sobre el tránsito GI durante el uso de bajas cantidades de compuesto. En este método, pez cebra larval (7 días post fertilización) son alimentadas con alimentos que contienen una etiqueta fluorescente. Después de la alimentación, cada pez larval es colocado en un pocillo de una placa de 96-cónico-parte inferior-bien y dosificar con sustancia de ensayo (disuelto en agua) o vehículo. Como se produce el tránsito del intestino, materia fecal se acumula en el fondo de los pozos, y la tasa a la cual esto sucede se controla midiendo la fluorescencia del fondo del pozo varias veces con el tiempo usando un espectrofotómetro de placa. La fluorescencia de las larvas en un grupo determinado tratamiento son promedio y se graficaron estos valores junto con el error estándar, para cada tiempo de medición, produciendo una curva que representa el tránsito promedio de alimentos en el tiempo. Efectos en el tiempo de tránsito intestinal se identifican comparando el área bajo la curva para cada grupo de tratamiento a el grupo tratado con vehículo. Este método detecta cambios en el tiempo de tránsito GI pez cebra inducido por fármacos con efectos GI clínicos conocidos; puede ser empleado para interrogar a decenas de tratamientos para efectos GI por día. Como tal, más seguros compuestos pueden rápidamente priorizarse para pruebas de mamíferos, que acelera el avance de 3R de descubrimiento y puedeo.
Pez cebra (Danio rerio) se utilizan para modelo biología vertebrado y predecir la toxicidad de la droga o eficacia; nuevas aplicaciones en estos campos surgen cada año. Las ventajas del pez cebra en modelos de mamíferos incluyen su fecundidad, tamaño pequeño y la transparencia a través de la organogénesis. Pez cebra se utilizan para predecir candidato aguda toxicidad de la droga, así como para evaluar impacto compuesto en función del órgano, por ejemplo, cardiaca, ocular, gastrointestinal (GI)1,2. Fisiología y desarrollo del pez cebra son similares a los de los mamíferos en muchas maneras3 y 80% de los genes que están asociados con enfermedad humana tienen un pez cebra homólogo4.
El tubo digestivo del pez cebra tiene fisiología similar al tracto GI mamífero pero tiene una sencilla arquitectura5. Pez cebra no tienen estómago; el anterior foco intestinal actúa como un depósito de alimentos. Expresión génica en el intestino del pez cebra tiene muchas similitudes a la de los mamíferos5. Como los mamíferos, el sistema nervioso entérico del pez cebra controla la motilidad intestinal y la inervación intestinal refleja la de otros vertebrados6,7. En base a estas semejanzas, trastornos funcionales del intestino humano han sido estudiados en el pez cebra, mediante métodos derivados de modelos mamíferos8.
Intolerancia GI durante ensayos clínicos de medicamentos es común y puede representar una grave amenaza para la salud humana. Una revisión de los programas en una importante empresa farmacéutica durante 2005 – 2010 reveló seguridad GI como la causa principal del estudio clínico terminaciones9el 9%. Pruebas de toxicidad gastrointestinal en modelos preclínicos de mamíferos pueden ser costosos en términos de tiempo, compuesto y mano de obra. Un análisis predictivo de alto rendimiento para el tránsito GI puede proporcionar flexibilidad para pruebas de toxicidad de compuestos y brindan un impacto de 3R. El protocolo descrito en el presente documento presenta un método novedoso que ofrece un análisis de tal. Este ensayo de alto rendimiento podría emplearse temprano en el desarrollo de drogas para dar prioridad a los candidatos y contribuir a la reducción de seguridad GI en especies mayores.
El método de Espectrofotometría novela de medición del larvas de pez cebra GI tiempo para tránsito, presentada aquí, es un análisis eficiente que puede predecir los efectos del tratamiento sobre mamífero GI-función. Aunque la prueba tiene baja sensibilidad, tiene alta predecibilidad positivo, que es aceptable para los primeros ensayos de nivel empleados para pelado abajo el número de tratamientos de candidato basado en toxicidad12. Este método es más fácil de ejecutar, tiene un mayor rendimiento y utiliza menos animal manejo pasos que microscopia fluorescente.
Hay desafíos técnicos inherentes a este método. Captura de larvas individuales después de alimentación los alimentos fluorescente y transferirlos en pocillos individuales es difícil al principio. Sin embargo, con la práctica, un técnico especializado puede llenar una placa de 96 pozos en menos de 15 minutos. Si, en un momento dado, la placa accidentalmente se sacude y la materia fecal sin resolver desde el fondo de los pozos antes de la lectura, la acumulación parece disminuir. Esto puede evitarse mediante el movimiento de la placa con cuidado, sin agitar. En nuestra experiencia, el movimiento normal, incluido el de la placa espectrofotómetro motorizado el cajón, no molestar el ensayo. Los lectores equipados con un calentador de la placa (es decir, la placa no tiene que devolverse a la incubadora entre mediciones) y situado cerca del ensayo de banco de laboratorio podría optimizar para menor posibilidad de disturbio, pero esto no era necesario en nuestra experiencia.
Primeros intentos en el método no incluye la alimentación en los días antes del ensayo. Sin las alimentaciones de la ‘práctica’, un menor número de larvas consume suficiente alimento fluorescente durante el tiempo permitido antes de la aplicación del tratamiento. En esos intentos, variación dentro de grupos de tratamiento fue mayor, y más datos fueron inservibles debido a la acumulación de bajo/sin señal en el tiempo. Incluso con la práctica de alimentación, algunas larvas no consumen cantidades suficientes de los alimentos fluorescente, excluyendo los datos de esas larvas disminuye la variación dentro de grupos y aumenta la capacidad para identificar los efectos del tratamiento. A partir de tamaños de grupo más grandes (es decir, 24 versus 12) permite un número suficiente de larvas aportando datos útiles para el análisis.
La microscopía fluorescente revela que el tránsito de alimentos fue casi completo por 24 h en larvas tratadas con atropina (no mostrado), sin embargo los datos de microplacas desde el punto de tiempo final reflejan menor señal final en el grupo de la atropina, en comparación con el grupo vehículo. Por el contrario, mayor fluorescencia final microplacas se asoció con tratamientos que aceleran el tiempo de tránsito, a pesar de que las larvas tratadas con vehículo al parecer han anulado su tracto GI antes del tiempo final. En base a la asignación aleatoria al tratamiento de larvas alimentada alimentos fluorescente, asumimos equivalente consumo de los alimentos fluorescente, en promedio, entre grupos de tratamiento. En vista de ello y basado en los patrones descritos anteriormente, fluorescencia de materia fecal disminuye con la permanencia en el tracto gastrointestinal larval o tránsito rápido agrega fluorescencia a las heces de alguna manera. La causa real es desconocida y no ha sido interrogada, sin embargo, el análisis todavía es capaz de medir y comparar el tiempo de tránsito entre los grupos.
El empleo de este método en la detección de efectos tóxicos de la GI de compuestos de pequeñas moléculas es una aplicación. Otras posibles aplicaciones incluyen modelado de enfermedad (p. ej., síndrome del intestino irritable) y descubrimiento de nueva terapia para este tipo de enfermedades, o para descubrir compuestos pro-kinetic. Además, junto con modelos transgénicos, este método podría utilizarse para cuestionar el papel de los genes en el normal tránsito GI, así como trastornos de tránsito, incluyendo deficiencia de neuronas entéricas. La larva de pez cebra ofrece una plataforma de todo organismo a escala que se aproxima a la de cultivo celular, pero ya que hay varios tejidos y tipos de células múltiples funcionando juntos en el pez cebra, preguntas de Biología de sistemas se le pueden pedir y contestar usando esto modelo.
Con los avances en la tecnología y sus nuevas aplicaciones, eficiencia en la realización de pruebas de toxicidad del pez cebra continuará mejorando. Pez cebra larvas manejo de métodos y ensayos continúan mejorar en términos de mayor rendimiento13,14. El nuevo método presentado aquí es un ejemplo de una mejora que haga estudios de pez cebra más impactantes.
The authors have nothing to disclose.
Simon Cassar de carpetbones.com diseñó y creó la figura de animación utilizada para demostrar el procedimiento en la vida de la prueba de tránsito GI.
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |