Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы измерить время транзита дневно обозначенные пищи через кишечник личинки данио рерио в духе высокой пропускной способности.
Данио рерио используются как альтернативная модель организмов для тестирования безопасности препарата. Желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) данио рерио имеет генетические, нейронов и фармакологические сходство млекопитающих. GI нетерпимости во время клинических испытаний наркотиков кандидатов является общим и могут представлять серьезную угрозу для здоровья человека. Тестирование для GI токсичности в доклинических моделях млекопитающих может быть дорогостоящим с точки зрения времени, тест соединения и труда. Метод высок объём, представленные здесь может использоваться для прогнозирования GI вопросов безопасности. По сравнению с млекопитающих модели, этот метод позволяет более целесообразным оценки теста составные воздействия на GI транзита при использовании низких количествах соединения. В этом методе, личинок данио рерио (7 дней после оплодотворения) вводятся продукты, содержащие флуоресцентные метки. После кормления, каждый личинок рыб помещается в колодец 96-конической нижней ну плиты и дозированной с тест соединения (растворимые в воде) или транспортного средства. Как происходит кишечник транзитом, фекалиями накапливается в нижней части скважины, и скорость, с которой это происходит контролируется путем измерения флуоресценции в нижней части скважины неоднократно со временем, используя спектрофотометр пластины. В среднем флуоресценции из личинки в группе данного обращения и эти значения являются графике вместе со стандартной ошибки, для каждого измерения времени, уступая кривой, представляющих средний транзит пищевых продуктов с течением времени. Воздействие на кишечник транзитное время определяются путем сравнения площадь под кривой для каждой группы лечения, транспортное средство лечение группы. Этот метод обнаружены изменения в zebrafish GI транзитное время индуцированные препараты с известными клинические эффекты GI; Он может быть использован допросить десятки для GI эффекты в день лечения. Таким образом безопасного соединения может быть быстро приоритеты для млекопитающих тестирования, который ускоряет обнаружение и proffers 3Rs улучшению.
Данио рерио (Danio рерио) используются для моделирования биологии позвоночных и предсказать токсичности препарата и/или эффективности; новые приложения в этих полях появляются каждый год. Преимущества данио рерио млекопитающих модели включают в себя их плодовитость, малый размер и прозрачность через органогенеза. Данио рерио используются для прогнозирования кандидат острой токсичности препарата, а также качественно оценивать составные влияние на функции органа, например, инфаркт, глазной, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)1,2. Данио рерио развития и физиологии аналогичны млекопитающих в много путей3 и 80% генов, которые связаны с болезнью человека имеют zebrafish гомолога4.
Желудочно-Кишечного тракта у рыбок данио имеет аналогичные физиологии для млекопитающих желудочно-Кишечного тракта, но имеет простой архитектуры5. Данио рерио имеют не желудка; передней кишечных колбы действует как еда депо. Экспрессии генов в кишечнике данио рерио имеет много сходств, млекопитающих5. Как млекопитающие кишечные нервной системы у рыбок данио контролирует сократительной способности кишечника и иннервации кишечника зеркала у других позвоночных6,7. На основании этого сходства, функциональные расстройства кишечника человека были изучены в данио рерио, используя методы, производные от млекопитающих модели8.
GI нетерпимости во время клинических испытаний наркотиков кандидатов является общим и могут представлять серьезную угрозу для здоровья человека. Обзор программ в крупной фармацевтической компании в течение 2005 – 2010 показал GI безопасности как главной причиной для 9% клинического исследования прерывание9. Тестирование для GI токсичности в доклинических моделях млекопитающих может быть дорогостоящим с точки зрения времени, составные и труда. Прогнозирования assay высокой пропускной способностью для GI транзита может обеспечить гибкость усложняет тестирование токсичности и доставить 3Rs воздействия. Новый метод, предлагая такие assay представлен протокол, описанные здесь. Этот assay высокой пропускной способности могут быть использованы в начале разработки лекарств приоритеты кандидатов, и способствовать сокращению GI безопасности испытаний в более крупных видов.
Роман спектрофотометрии метод для измерения данио рерио личинки GI время транзита, представленная здесь, является эффективным assay который может предсказать влияние лечения на млекопитающих GI-функции. Хотя assay имеет низкую чувствительность, он имеет высокий положительный predictivity, который является приемлемым для первого уровня анализов, используемых для урезая количество кандидатов процедуры, основанные на токсичность12. Этот метод проще выполнять, имеет более высокую пропускную способность и использует меньше животных обработки шагов, чем флуоресцентной микроскопии.
В этом методе присущи технические проблемы. Ловить отдельных личинок после кормления флуоресцентные пищи и передачи их в индивидуальные добра является сложной задачей в первую очередь. Однако с практикой, квалифицированный техник может заполнить 96-луночных пластины в менее чем за 15 мин. Если в данный момент точке, случайно потряс пластину и фекалиями неурегулированных в нижней части скважины перед чтением, накопление появится снижаться. Этого можно избежать путем перемещения знаке осторожно, без встряхивания. По нашему опыту нормальное движение, в том числе моторизованные ящик плиты спектрофотометр, не мешали assay. Пластина читателей с утеплителем (т.е., плиты не должны быть возвращены в инкубатор между измерениями) и расположена вблизи пробирной лаборатории скамейке может оптимизировать для меньше шансов помеха, но это не было необходимым в нашем опыте.
Ранние попытки метода не включает питание в дни перед assay. Без этих «практика» кормлений меньшее количество личинок потребляется достаточно флуоресцентный пищи во время допускается до применения лечения. В этих попыток вариации в группах лечения было больше, и больше данных было непригодным для использования из-за накопления низкий/нет сигнала с течением времени. Даже с практикой кормления, некоторые личинки не потребляют достаточного количества продовольствия флуоресцентного, исключая данные из этих личинок уменьшается вариации в рамках групп и увеличивает способность определить эффекты лечения. Начиная с больших размеров группы (т.е. 24 против 12) позволяет достаточное количество личинок, предоставляющих полезные данные для анализа.
Флуоресцентной микроскопии показывает, что питание транзита был почти полный 24 ч в атропин лечение личинки (не показан), однако Гонав данных из точки последний раз отражают нижней окончательный сигнал в группе атропина, по сравнению с группой транспортного средства. И наоборот выше окончательный Гонав флуоресценции был связан с процедурами, которые ускорили время транзита, даже несмотря на то, что транспортное средство лечение личинки явно аннулировал их желудочно-Кишечного тракта перед точкой последний раз. Основываясь на случайных назначение лечения личинок, кормили флуоресцентные пищи, мы предполагаем, эквивалентное потребление флуоресцентные пищи, в среднем, среди групп лечения. Учитывая это и на основе шаблонов, описанных выше, флуоресценции с фекалиями снижается с время, проведенное в личиночной желудочно-Кишечного тракта или быстрее транзита добавляет флуоресценции в фекалиях каким-то образом. Фактическая причина неизвестна и не был допрошен, однако assay еще способен измерения и сравнения времени транзита между группами.
Работы этого метода для обнаружения токсичных эффектов GI от маленькой молекулы соединений является одним из приложений. Другие возможные применения включают болезни моделирования (например, синдром раздраженного кишечника) и открытие новой терапии для таких заболеваний, или для открытия pro кинетические соединений. Кроме того в сочетании с transgenic моделей, этот метод может использоваться для допросить роль генов в нормальной GI транзита, а также транзитных расстройств, включая дефицит кишечных нейрон. Данио рерио личинка предлагает весь организм платформу в масштабе, что приближается что культивирования клеток, но поскольку есть несколько тканей и типов множества клеток, функционирования вместе в данио рерио, вопросы биологии систем могут быть заданы и ответил, с помощью этого модели.
С достижениями в технологии и их новых приложений эффективность при проведении испытаний на токсичность данио рерио будет продолжать совершенствовать. Личинок данио рерио, обработки методы и анализов продолжает улучшения с точки зрения выше пропускная способность13,14. Новый метод, представленные здесь является одним из примеров улучшения, которые могут сделать данио рерио исследования более впечатляющие.
The authors have nothing to disclose.
Симон Кассар carpetbones.com разработан и создан анимированный рисунок, используемый для демонстрации в жизнь процедуры анализа транзитных GI.
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |