Fluorimétrique Techniques pour l’évaluation des Membranes des spermatozoïdes
Summary
Nous présentons ici les méthodes pour évaluer l’intégrité membranaire de spermatozoïde, une fonctionnalité cellulaire associée à compétence de fertilisation de sperme. Nous décrivons trois techniques pour l’évaluation fluorimétrique des membranes des spermatozoïdes : coloration simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques, microscopie à fluorescence et avancé cytométrie dédiés au sperme. Exemples de combiner les méthodes sont également présentés.
Abstract
Spermiograms standards décrivant la qualité du sperme sont principalement basées sur les paramètres physiologiques et visuels, tels que le volume de l’éjaculat et concentration, mobilité et motilité progressive et la morphologie des spermatozoïdes et la viabilité. Cependant, aucun de ces évaluations est assez bon pour prédire la qualité de sperme. Étant donné que le maintien de la viabilité des spermatozoïdes et la fécondation potentielle dépend de l’intégrité membranaire et intracellulaire fonctionnalité, évaluation de ces paramètres pourrait permettre une meilleure prédiction de la compétence de la fécondation de sperme. Nous décrivons ici trois méthodes possibles pour évaluer la qualité du sperme à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques combinées avec des analyses fluorescence microscopie ou écoulement cytometry. Analyses a évalué l’intégrité de la membrane plasmique avec 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’iodure de propidium (PI), intégrité de la membrane acrosomique utilisant conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine agglutinine de Pisum sativum (FITC-PSA) et intégrité de la membrane mitochondriale à l’aide de 5, 5′, 6, 6′-tétra-chloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodure (JC-1). Combinaisons de ces méthodes sont également présentées. Par exemple, utilisation de l’annexine V combiné avec permet de fluorochromes PI évaluant l’apoptose et de calculer la proportion de spermatozoïdes apoptotiques (index apoptotique). Nous croyons que ces méthodes, qui reposent sur l’examen des membranes de spermatozoïde, sont très utiles pour l’évaluation de la qualité du sperme.
Introduction
L’intégrité et la fonctionnalité des membranes des spermatozoïdes sont quelques-uns des facteurs indiquant la viabilité des spermatozoïdes et la fécondation potentielle. La membrane plasmique agit comme une barrière entre les compartiments intracellulaires et extracellulaires, préservant ainsi l’ équilibre osmotique cellulaire1. Tout stress qui provoque des dommages à l’intégrité de la membrane plasmique pourrait nuire à l’homéostasie, réduire la capacité de viabilité et de la fertilisation et augmenter la mort cellulaire. Par exemple, cryoconservation réduit la viabilité de sperme la dommages à sa membrane plasmique, par suite de changements de température et de stress osmotique2. Nous avons déjà indiqué que l’exposant de sperme de taureau à de faibles concentrations de contaminants d’origine alimentaire tels que l’atrazine de pesticides, son principal métabolite diaminochlorotriazine ou l’aflatoxine mycotoxine B1, réduit sperme viabilité1,3 . Cela a été déterminé par marquage de l’ADN double-brin au DAPI en combinaison avec PI, qui se lie à l’ADN des cellules avec une membrane plasmique endommagée.
Réaction de l’acrosome (AR) implique la fusion de la membrane de l’acrosome externe et la membrane plasmique sus-jacente, aboutissant à la libération d’enzymes acrosomique4,5. Voici les événements essentiels pour pellucide pénétration et plus loin la fusion du spermatozoïde avec l’ ovocyte6. En conséquence, l’évaluation de l’intégrité membranaire acrosomique constitue un paramètre utile pour évaluer la qualité du sperme et la fertilité masculine7,8,9. Plusieurs techniques de fluorescence sont appropriés pour la vérification de l’intégrité de l’acrosome, FITC-PNA ou FITC-PSA8,10. Dans nos études précédentes, en utilisant les patrons de PSA FITC coloration1,3, nous fournit des définitions précises de (i) acrosome intact, (ii) endommagé la membrane de l’acrosome et (iii) a réagi acrosome. Dans le présent rapport, nous évaluer l’état d’acrosome cytométrie dédiés au sperme et comparer les résultats à ceux utilisant la microscopie à fluorescence.
Les mitochondries sont des organites multifonctionnels impliqué dans, entre autres choses, ATP synthèse, production d’espèces oxygénées radicalaires, signalisation calcique et l’apoptose. Des dysfonctionnements physiologiques, y compris la stérilité masculine et féminine, sont associés à l’altération de la fonction mitochondriale11. Mitochondries du sperme sont disposées dans la pièce et jouent un rôle crucial dans la motilité de sperme12. Il est bien reconnu que haut potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨm) est associé à la motilité normale et fertilisation haute capacité13. En revanche, ΔΨm faible est associé à un niveau élevé d’espèces réactives de l’oxygène et réduit le taux de fécondation14. Néanmoins, divers composés environnementaux, par exemple de perturbateurs endocriniens, peuvent provoquer le stress cellulaire et conduisent à une augmentation transitoire de la ΔΨm, hyperpolarisation1,3, augmentation de la production de radicaux libres et, éventuellement, 15de l’apoptose. La sonde fluorescente 5, 5′, 6, 6′-tétra-chloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodure (JC-1) permet d’examiner par exemple, les effets des toxines d’origine alimentaire sur sperme ΔΨm1,3.
Spermiograms standards, en fonction des paramètres physiologiques et morphologiques, ne sont pas assez bons pour prédire la qualité de sperme. Des méthodes plus précises sont nécessaires pour assurer la qualité du sperme. Ici, nous fournissent deux méthodes possibles pour déterminer la qualité du sperme fondée sur des évaluations des membranes des spermatozoïdes : coloration quadruple simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques et la microscopie de fluorescence, décrit dans nos études1,3 et cytométrie en flux de sperme-dédiée avancée, utilisées récemment dans notre laboratoire et déjà utilisé par d’autres16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fertilisation de sperme potentielle dépend de multiples facteurs reflétant sa qualité. Une forte concentration de spermatozoïdes et une forte proportion des spermatozoïdes très progressivement pourraient considérer sperme de haute qualité. Néanmoins, une telle évaluation ne prend pas en compte autres paramètres cellulaires et fonctionnelles. L’utilisation de « table » microcapillaire cytomètre de flux peut être facilement adaptée à l’évaluation des différentes structures de sperme à l’aide de …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier la société israélienne « SION » pour l’insémination artificielle et l’élevage (Hafetz Haim, Israël) pour leur aide et coopération et d’assistance avec le réglage de l’instrument et la formation de Mme Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, France).
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
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