정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법
Summary
여기, 우리는 spermatozoan 막 무결성, 정자의 수정 능력와 관련 된 세포 기능을 평가 하는 방법론을 제시. 우리 정자 세포 막의 fluorimetric 평가 대 한 세 가지 기술에 설명: 특정 형광 프로브, 형광 현미경 검사 법, 그리고 고급 정자 전용 cytometry 동시 얼룩. 방법론을 결합의 예제도 제공 됩니다.
Abstract
정자의 품질을 설명 하는 표준 spermiograms 주로 생리 및 시각적 매개 변수, 사정 및 농도, 운동 성 및 진보적인 운동 성, 정자 형태 및 생존 능력 등 기준으로 합니다. 그러나, 이러한 평가은 충분히 정액 질을 예측 하는 좋은입니다. 그의 정자 생존 및 잠재적인 수정 유지 보수 막 무결성 및 세포내 기능에 따라, 이러한 매개 변수 평가 수 가능 정자의 수정 능력의 더 나은 예측 여기, 형광 현미경 검사 법 또는 흐름 cytometry 분석 결합 된 특정 형광 프로브를 사용 하 여 정자의 품질을 평가 하 세 가지 가능한 방법을 설명 합니다. 분석 평가 플라즈마 멤브레인 무결성 4′, 6-diamidino-2-phenylindole를 사용 하 여 (DAPI) 및 propidium 요오드 화물 (PI), acrosomal 막 무결성 fluorescein isothiocyanate 활용을 사용 하 여 Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) 및 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성 사용 하 여 5, 5′ 6, 6′-tetra-클로-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine 요오드 화물 (JC-1). 이러한 방법의 조합 또한 제공 됩니다. 예를 들어, annexin V의 사용 apoptosis를 평가 하 고 apoptotic 정자 (apoptotic 인덱스)의 비율을 계산 PI 형광 수와 결합. 우리 정자 막 검사에 근거 하는 이러한 방법론은 정자 품질 평가 대 한 매우 유용 합니다 믿습니다.
Introduction
정자 세포 막의 기능과 무결성 정자 생존 및 수정 가능성를 나타내는 요인 중 몇 가지 있습니다. 원형질 막 세포 삼 투 평형1유지 세포내와 세포 외 구획 사이 방 벽 역할을 합니다. 원형질 막 무결성에 손상을 유도 스트레스 항상성 손상, 생존 능력 및 수정 능력을 감소 되 고 증가 세포 죽음. 예를 들어, cryopreservation 온도 변화 및 삼투성 스트레스2결과로 그것의 원형질 막에 손상에 인해 정자 생존 능력을 감소 시킨다. 우리는 이전 그 정자 생존1,3 감소 불 정자 농약 아트 가진, 그것의 주요 대사 산물 diaminochlorotriazine 등 mycotoxin 아플 라 톡 신 B1, 식중독 오염 물질의 낮은 농도에 노출 보고 . 이 손상 된 원형질 막 세포의 DNA에는 PI와 함께에서 DAPI와 이중 가닥 DNA 라벨 의해 결정 되었다.
Acrosome 반응 (AR) 외부 acrosome 막 및 acrosomal 효소4,5의 출시에 따른 overlying 원형질 막의 융해를 포함 한다. 이들은 zona pellucida 침투 및 추가 oocyte6정자의 병합을 위해 필수적인 행사입니다. 따라서, acrosomal 막 무결성의 평가 정액 질 및 남성 불 임7,,89평가 하는 유용한 매개 변수를 구성 합니다. 여러 형광 기법 acrosome 무결성, PNA FITC FITC PSA8,10의 확인을 위해 적당 하다. FITC PSA 얼룩1,3의 패턴을 사용 하 여 우리의 이전 연구에서 우리는 그대로 acrosome (i)에 대 한 정확한 정의 제공 (ii) acrosome 막 손상 하 고 (iii) acrosome 반응. 현재 보고서에서 우리 정자 전용 cytometry를 사용 하 여 acrosome 상태를 평가 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 그 결과 비교.
Mitochondria은 다기능 세포에, ATP 합성, 반응성 산소 종 생산, 칼슘 신호 및 apoptosis에 관여. 생리 장애, 남성 및 여성 불 임을 포함 한 변경 된 미토 콘 드리 아 기능11와 연결 됩니다. 정자의 미토 콘 드리 아는 midpiece에서 배열 되 고 정자 운동 성12에서 중요 한 역할. 그것은 잘 높은 미토 콘 드리 아 막 잠재력 (ΔΨm)은 정상적인 운동 성 및 높은 수정 용량13와 연결을 허용 합니다. 대조적으로, 낮은 ΔΨm 반응성 산소 종의 높은 수준에 연결 하 고 수정 속도14감소. 그럼에도 불구 하 고, 다양 한 환경 화합물, 예를 들면 내 분 비 분리기, 수 세포 스트레스를 유발 하 고 ΔΨm, hyperpolarization1,3, 그리고 결국, 자유 래 디 칼의 생산 증가에 일시적인 증가를 끌 apoptosis15. 형광 프로브 5, 5′ 6, 6′-tetra-클로-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine 요오드 화물 (JC-1) 예를 들어 정자 ΔΨm1,3에 식중독 독 소의 효과 조사 가능.
표준 spermiograms, 생리 및 형태학 매개 변수에 따라 충분히 정액 질을 예측 하는 좋지 않다. 더 정확한 방법은 정자의 품질을 보장 하기 위해 필요 합니다. 여기, 우리는 정자 세포 막의 평가에 따라 정자의 품질을 결정 하기 위해 두 가지 가능한 방법 제공: 형광 현미경 검사 법, 우리의 연구1,3 에 설명 된 특정 형광 프로브와 동시 콰 얼룩 그리고 고급 정자 전용 cytometry, 최근 활용 우리의 실험실과 다른 사람에 의해 이미 사용 되 고16,,1718.
Protocol
Representative Results
Discussion
정자의 수정 가능성의 품질을 반영 하는 여러 요인에 따라 달라 집니다. 정 충의 높은 농도 매우 점진적으로 운동 정 충의 높은 비율에 게 높은-품질 정액을 고려 될 수도 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그러한 평가를 고려 하지 않는 다른 세포 및 기능 매개 변수. ‘ 벤치 맨 ‘ microcapillary 교류 cytometer 사용 하 여 이전17 다른 사람에 의해 표시 하 고 시연 여기 (기술 #3) 형광 프로브?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 도움과 협력, 양 리 나 (IMV 기술, L’Aigle, 프랑스) 계기 설치 및 훈련에 대 한 인공 수정 및 번 식 (Hafetz 임, 이스라엘)에 대 한 “수도회” 이스라엘 회사를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
Referenzen
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