Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma
Summary
Aqui, apresentamos metodologias para avaliar a integridade de membrana spermatozoan, uma celular característica associada com a competência de fertilização do espermatozoide. Nós descrevemos três técnicas para a avaliação de fluorimétrica de membranas de esperma: coloração simultânea com sondas fluorescentes específicas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma. Também são apresentados exemplos de combinar as metodologias.
Abstract
Spermiograms padrão, descrevendo a qualidade do esperma baseiam-se principalmente os parâmetros fisiológicos e visuais, tais como o volume de ejaculação e concentração, motilidade e motilidade progressiva e morfologia do esperma e viabilidade. No entanto, nenhuma destas avaliações é bom o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Dado que a manutenção da viabilidade do esperma e fertilização potencial depende da integridade de membrana e funcionalidade intracelular, avaliação desses parâmetros poderá permitir uma melhor previsão de competência de fertilização do espermatozoide. Aqui, descrevemos três métodos viáveis para avaliar a qualidade do esperma utilizando sondas fluorescentes específicas, combinadas com análises de citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. Análises avaliaram integridade de membrana plasmática usando 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e iodeto de propidium (PI), integridade da membrana acrossomal usando conjugada com isotiocianato de fluoresceína aglutininas Pisum sativum (FITC-PSA) e integridade de membrana mitocondrial usando 5, 5′, 6, 6-tetra-chloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1). Combinações destes métodos também são apresentadas. Por exemplo, uso de anexina V combinado com ativa de fluorochromes PI avaliar apoptose e calcular a proporção de espermatozoides apoptotic (índice apoptótico). Acreditamos que essas metodologias, que são baseadas em examinar as membranas do espermatozoide, são muito úteis para a avaliação da qualidade do esperma.
Introduction
Integridade e funcionalidade de membranas de esperma são alguns dos fatores indicando a viabilidade do esperma e fertilização potencial. A membrana plasmática funciona como uma barreira entre os compartimentos intracelulares e extracelulares, mantendo assim o equilíbrio osmótico celular1. Qualquer estresse que induz os danos para a integridade da membrana plasmática pode prejudicar a homeostase, reduzir a capacidade de viabilidade e fertilização e aumentar a morte celular. Por exemplo, criopreservação reduz viabilidade de esperma devido a danos a sua membrana plasmática, como resultado de mudanças de temperatura e estresse osmótico2. Informamos anteriormente que expondo o esperma de touro a baixas concentrações de contaminantes de origem alimentar como o pesticida atrazine, diaminochlorotriazine seu metabolito principal ou a aflatoxina micotoxina B1, reduz a viabilidade de esperma1,3 . Isso foi determinado pela rotulagem o DNA de cadeia dupla com DAPI em combinação com PI, que se liga ao DNA de células com uma membrana plasmática danificada.
Reacção acrossómica (AR) envolve a fusão da membrana externa do acrossoma e membrana plasmática sobrejacente, resultando na liberação de enzimas acrossomal4,5. Estes são eventos essenciais para a penetração da zona pelúcida e ainda mais a fusão do espermatozoide com o oócito6. Portanto, a avaliação da integridade da membrana acrossomal constitui um parâmetro útil para avaliar a qualidade do sêmen e a fertilidade masculina7,8,9. Várias técnicas fluorescentes são adequadas para a verificação de integridade do acrossoma, FITC-PNA ou FITC-PSA8,10. Em nossos estudos anteriores, usando os padrões de FITC-PSA coloração1,3, desde as definições precisas para (i) acrossoma intacta, (ii) danificado da membrana do acrossoma e (iii) reagiu acrossoma. No relatório atual, podemos avaliar o status de acrossoma usando citometria de fluxo de esperma-dedicado e comparar os resultados com aqueles usando microscopia de fluorescência.
As mitocôndrias são organelas multifuncionais envolvido em, entre outras coisas, ATP síntese, produção de espécies reactivas de oxigénio, sinalização de cálcio e apoptose. Disfunções fisiológicas, incluindo a infertilidade masculina e feminina, estão associadas com alteração da função mitocondrial11. Mitocôndrias de esperma são arranjadas na peça intermediária e desempenham um papel crucial no esperma motilidade12. É bem aceite que o elevado potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) está associado a motilidade normal e alta fertilização capacidade13. Em contraste, ΔΨm baixo está associado um nível elevado de espécies reativas de oxigênio e reduzida taxa de fertilização14. Não obstante, vários compostos ambientais, por exemplo, desreguladores endócrinos, podem induzir estresse celular e levar a um aumento transiente da hiperpolarização1,3, ΔΨm, aumento da produção de radicais livres e, eventualmente, apoptose,15. A sonda fluorescente 5, 5′, 6, 6-tetra-chloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1) permite por exemplo, examinando os efeitos de toxinas de origem alimentar no esperma ΔΨm1,3.
Spermiograms padrão, com base nos parâmetros fisiológicos e morfológicos, não são bons o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Métodos mais precisos são necessários para assegurar a qualidade do esperma. Aqui, nós fornecemos dois métodos viáveis para determinar a qualidade do esperma com base em avaliações de membranas de esperma: coloração quádruplo simultânea com sondas fluorescentes específicas e microscopia de fluorescência, descrito em nossos estudos1,3 e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma, recentemente utilizado em nosso laboratório e já está sendo usado por outros16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fecundação do esperma potencial depende de múltiplos fatores, refletindo sua qualidade. Uma alta concentração de espermatozoides e uma elevada proporção de espermatozoides móveis altamente progressivamente podem ser considerados o sêmen de alta qualidade. No entanto, essa avaliação não leva em conta outros parâmetros celulares e funcionais. O uso de ‘bancada’ conta citômetro de fluxo pode ser facilmente adaptado para avaliação de várias estruturas de esperma utilizando sondas fluorescentes, como mostrado…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer sua ajuda e cooperação e MS. Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, França) para obter assistência com a instalação do instrumento e formação empresa israelense “SION” para inseminação artificial e reprodução (Hafetz-Haim, Israel).
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
Referenzen
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