Fluorimetrischen Techniken für die Beurteilung der Spermien Membranen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Spermatozoan Membran Integrität, eine zelluläre Funktion verbunden mit Sperma Befruchtung Kompetenz zu bewerten. Wir beschreiben drei Techniken für die fluorimetrischen Beurteilung der Spermien Membranen: gleichzeitige Färbung mit spezifischen fluoreszierende Sonden, Fluoreszenz-Mikroskopie und erweiterte Spermien gewidmet Durchflusszytometrie. Beispiele für die Kombination der Methoden werden ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Standard Spermiograms beschreiben Spermienqualität basieren meist auf die physiologischen und visuelle Parameter wie Ejakulatvolumen und Konzentration, Motilität und progressive Motilität und Morphologie der Spermien und Lebensfähigkeit. Keiner dieser Bewertungen ist jedoch gut genug, um die Qualität des Spermas vorherzusagen. Da die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Spermien und potenzielle Befruchtung Membran Integrität und intrazellulären Funktionalität abhängt, könnte Bewertung dieser Parameter eine bessere Vorhersage der Spermien Befruchtung Kompetenz ermöglichen. Hier beschreiben wir drei machbare Methoden zur Beurteilung der Spermienqualität mit spezifischen fluoreszierende Sonden kombiniert mit Fluoreszenz-Mikroskopie oder Flow-Zytometrie-Analysen. Analysen beurteilt Plasmamembran Integrität mit 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und Propidium Jodid (PI), acrosomal Membran Integrität mit Fluorescein erfolgt konjugiert Pisum Sativum Agglutinin (FITC-PSA) und Mitochondrien-Membran Integrität mit 5, 5′, 6, 6′-Tetra-Chloro-1, 1′, 3, 3′-Tetraethylbenzimidazolyl Carbocyanine Jodid (JC-1). Kombinationen dieser Methoden werden ebenfalls vorgestellt. Zum Beispiel kombinierten Einsatz von annexin V mit PI Fluorochromes ermöglicht Apoptose Bewertung und Berechnung des apoptotischen Spermien (Apoptose-Index). Wir glauben, dass diese Methoden, die bei der Prüfung der Samenzelle Membranen basieren, sehr nützlich für die Bewertung der Qualität der Spermien sind.
Introduction
Integrität und Funktionalität der Spermien Membranen sind einige der Angabe Lebensfähigkeit der Spermien und Befruchtung mögliche Faktoren. Die Plasmamembran wirkt wie eine Barriere zwischen den intrazellulären und extrazellulären Abteilen, damit Aufrechterhaltung der zellulären osmotische Gleichgewicht1. Stress, die Schäden an der Plasmamembran Integrität induziert möglicherweise beeinträchtigen Homöostase, Lebensfähigkeit und Düngung Kapazität reduzieren und Zelltod zu erhöhen. Beispielsweise reduziert Kryokonservierung Lebensfähigkeit der Spermien durch zu Schäden an der Plasmamembran infolge Temperaturänderungen und osmotischen Stress2. Wir berichteten bereits, dass auszusetzen Bullensperma niedrigen Konzentrationen von lebensmittelbedingten Schadstoffe wie Pestizide Atrazin, seine wichtigsten Metaboliten Diaminochlorotriazine oder Mykotoxine Aflatoxin B1, reduziert Spermien Rentabilität1,3 . Dies wurde durch Kennzeichnung der doppelsträngigen DNS mit DAPI in Kombination mit PI, die bindet an die DNA von Zellen mit einer beschädigten Plasmamembran bestimmt.
Akrosom Reaktion (AR) beinhaltet Verschmelzung der äußeren Akrosom Membran und die darüber liegende Plasmamembran, was die Auflösung von acrosomal Enzymen4,5. Dies sind wesentliche Ereignisse für die Zona Pellucida eindringen und weitere Zusammenführung der Samenzellen mit der Eizelle6. Bewertung der acrosomal Membran Integrität somit einen nützlichen Parameter zur Bewertung der Qualität des Spermas und männliche Ergiebigkeit7,8,9. Verschiedene fluoreszierende Techniken eignen sich für die Überprüfung der Integrität von Akrosom, FITC-PNA oder FITC-PSA8,10. In unseren früheren Studien mit den Mustern der FITC-PSA Färbung1,3wir versehen genaue Definitionen für (i) intakt Akrosom, (Ii) Akrosom Membran beschädigt und (Iii) reagierten Akrosom. Im aktuellen Bericht wir bewerten Akrosom Status mithilfe von Spermien gewidmet Durchflusszytometrie und vergleichen Sie die Ergebnisse mit denen mit Fluoreszenz-Mikroskopie.
Die Mitochondrien sind multifunktionale Organellen beteiligt, unter anderem ATP Synthese, reaktiven Sauerstoff-Spezies-Produktion, Kalzium-Signalisierung und Apoptose. Physiologische Störungen, einschließlich der männlichen und weiblichen Unfruchtbarkeit sind veränderte Funktion der Mitochondrien11zugeordnet. Spermien Mitochondrien sind in der Midpiece angeordnet und spielen eine entscheidende Rolle in der Spermien-Motilität-12. Es wird gut angenommen, dass hohe mitochondriale Membranpotential (ΔΨm) normale Motilität und hoher Düngung Kapazität13zugeordnet ist. Im Gegensatz dazu niedrig ΔΨm ist verbunden mit einer erhöhten Niveau von reaktiven Sauerstoffspezies und Befruchtung Rate14reduziert. Dennoch können verschiedene ökologische Verbindungen, z.B. endokrine Disruptoren zellulären Stress auslösen und führen zu einem vorübergehenden Anstieg der ΔΨm, Hyperpolarisation1,3, erhöhte Produktion von freien Radikalen und schließlich, Apoptose-15. Die fluoreszierende Sonde 5, 5′, 6, 6′-Tetra-Chloro-1, 1′, 3, 3′-Tetraethylbenzimidazolyl Carbocyanine Jodid (JC-1) ermöglicht die Untersuchung beispielsweise die Auswirkungen der Foodborne Giftstoffe auf Sperma ΔΨm1,3.
Standard Spermiograms, basierend auf physiologische und morphologische Parameter sind nicht gut genug, um die Qualität des Spermas vorherzusagen. Genauere Methoden sind erforderlich, um Spermien-Qualität zu gewährleisten. Hier bieten wir zwei praktikable Methoden zur Bestimmung Spermienqualität basierend auf Bewertungen von Spermien Membranen: gleichzeitige vierfach Färbung mit speziellen fluoreszierenden Sonden und Fluoreszenz-Mikroskopie, beschrieben in unserem Studien-1,–3 und erweiterte Spermien gewidmet Durchflusszytometrie, vor kurzem in unserem Labor und bereits von anderen verwendet16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sperma Befruchtung potenzielle hängt von mehrere Faktoren die Qualität widerspiegelt. Eine hohe Konzentration der Spermien und einen hohen Anteil an sehr progressiv bewegliche Spermien könnte qualitativ hochwertige Samen betrachtet werden. Dennoch, eine solche Bewertung nicht berücksichtigt andere zelluläre und funktionelle Parameter. Die Verwendung von “Bench-Top” Microcapillary Durchflusszytometer kann zur Bewertung der verschiedenen Spermien Strukturen mit fluoreszierenden Sonden, wie zuvor von anderen<sup class=…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten “SION” israelische Gesellschaft für künstliche Befruchtung und Zucht (Hafetz-Haim, Israel) Danke für ihre Hilfe und Zusammenarbeit und Frau Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, Frankreich) für die Unterstützung bei der Inbetriebnahme und Schulung.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
Referenzen
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
