Wir präsentieren einen Fluoreszenz-Test, um zu zeigen, dass Lucifer Yellow (LY) ein robuster Marker ist, um die scheinbare parazelluläre Durchlässigkeit von hCMEC/D3-Zellmonolayern zu bestimmen, einem In-vitro-Modell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. Wir verwendeten diesen Assay, um die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen zu bestimmen.
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Methodenartikel
Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Blut- und Hirnschranke BBB besteht aus Endothelzellen, die eine Barriere zwischen dem systemischen Kreislauf und dem Gehirn bilden, um den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zu verhindern. Enge Knoten (TJ) versiegeln effektiv den parazellulären Raum in den Monolayern, was zu einer intakten Barriere führt. Diese Studie beschreibt einen LY-basierten Fluoreszenz-Assay, der zur Bestimmung seinesscheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) verwendet werden kann und wiederum verwendet werden kann, um die Kinetik der Bildung von konfluenten Monolayern und die daraus resultierende enge Kreuzung zu bestimmen. Barriereintegrität in hCMEC/D3-Monolayern. Darüber hinaus zeigen wir einen zusätzlichen Nutzen dieses Assays, um die funktionelle Integrität von TJ in transfizierten Zellen zu bestimmen. Unsere Daten aus dem LY P App-Test zeigen, dass die hCMEC/D3-Zellen, die in einem Transwell-Setup gesät wurden, den LY-Parazelltransport effektiv auf 7 Tage nach der Kultur beschränken. Als zusätzlichen Nutzen des vorgestellten Tests zeigen wir auch, dass die DNA-Nanopartikeltransfektion den LY-Parazelltransport in hCMEC/D3-Monolayern nicht verändert.
Einleitung
Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist die Schutzbarriere, die den Zustrom von Plasmakomponenten in das Gehirngewebe begrenzt und besteht aus Hirn-Endothelzellen zusammen mit unterstützenden Zellen wie Pericyten. Die Hauptrolle von BBB ist es, als Barriere zu dienen, die den Raum zwischen peripherem Blut und zentralem Nervensystem (ZNS) versiegelt, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung1,2zu erhalten. Die Hirnkapillaren-Endothelzellen versiegeln den parazellulären Weg effektiv durch Bildung interzellulärer enger Verbindungen (TJs)1. Diese Schutzbarriere ermöglicht glukose und ausgewählte....
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Protokoll
1.Allgemeine hCMEC/D3 Zellkultur
- Reanimation von gefrorenen Zellen
HINWEIS: Alle Zellkulturpflege- und Experimente wurden in einer sterilen Biosicherheitshaube durchgeführt. Kulturmedien, Nahrungsergänzungsmittel und Reagenzien wurden entweder als sterile Produkte gekauft oder über Filtration mit einem 0,22 m Membranfilter sterilisiert, um mikrobielle Kontaminationen zu verhindern.- 8,5 ml Kollagenlösung (0,15mg/ml) in einen Gewebekulturkolben (75 cm2 Wachstumsbereich; fortan T75) geben und 1 h in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2) geben.
- Entfernen Sie die Kollagenlösung und waschen Sie den Kolben vors....
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Ergebnisse
Zuerst haben wir den Effekt der Kultivierungszeit auf die LY-Permeabilität bestimmt, um die scheinbare Kinetik der TJ-Bildung zu bestimmen. Die durchschnittlichen LY P-App-Werte vom Tag 1 bis 10-Post-Seeding sind in Abbildung 2adargestellt. Am ersten Tag betrug die durchschnittlicheP-App 4,25 x 10-4 cm/min und fiel am 2. Tag leicht auf 3,32 x 10-4 cm/min. Der mittlere P-App-Wert stieg am 3. Tag leicht auf.......
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Diskussion
Eine Schlüsselrolle des BBB besteht darin, den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zwischen der systemischen Zirkulation und dem Gehirn zu verhindern, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Eines der charakteristischen Merkmale des BBB ist die Fähigkeit der Kapillaren-Endothelzellen, enge Knoten (TJs) zu bilden, die den parazellulären Transportweg effektiv versiegeln. Wir demonstrierten einen LY P App-Assay als quantitative Methode zur Bestimmung der schei.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch den New Investigator Award 2017 der American Association of Pharmacy, einen Hunkele Dreaded Disease Award der Duquesne University und die School of Pharmacy Start-up-Fonds für das Manickam-Labor. Wir möchten dem Leak-Labor (Duquesne University) für die Unterstützung durch western Blotting danken und die Verwendung ihres Odyssey 16-Bit-Imagers ermöglichen. Wir möchten auch eine besondere Dankesnote für Kandarp Dave (Manickam Labor) für die Hilfe bei western blotting.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| hCMEC/D3-Zelllinie | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | humane zerebrale mikrovaskuläre Endothelzelllinie |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid-DNA, die für das Luciferase-Gen kodiert |
| Luzifergelb, CH, Dilithiumsalz | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell-Einsätze mit spurgeätzten Membranen aus Polyethylenterephthalat (PET) | Falcon | 353095 | |
| Gewebekulturflasche | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-Well-Flachboden | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Schwarze 96-Well-Immunplatten | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-Minimum essentielles Medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Basalmedium für Endothelzellen-2(EBM-2) |
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Kollagen Typ I | Discovery Labware, Inc. | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| 5X Reagenz für die Zellkulturlyse | Promega | E1531 | |
| Käfer Luciferin, Kaliumsalz | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluoreszenzplatten-Reader | |
| Trypanblau-Lösung, 0,4 % | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyklonaler Antikörper | ThermoFisher | 61-7300 | |
| Anti-GAPDH-Antikörper | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-konjugiertes AffiniPure Donkey Anti-Maus LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-Well, flacher Boden | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA-Puffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx Imager | LI-COR Biosciences | zum Scannen von Western-Blot-Membranen |
Referenzen
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
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Nachdrucke und Genehmigungen
