Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere
Summary
Wir präsentieren einen Fluoreszenz-Test, um zu zeigen, dass Lucifer Yellow (LY) ein robuster Marker ist, um die scheinbare parazelluläre Durchlässigkeit von hCMEC/D3-Zellmonolayern zu bestimmen, einem In-vitro-Modell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. Wir verwendeten diesen Assay, um die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen zu bestimmen.
Abstract
Die Blut- und Hirnschranke BBB besteht aus Endothelzellen, die eine Barriere zwischen dem systemischen Kreislauf und dem Gehirn bilden, um den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zu verhindern. Enge Knoten (TJ) versiegeln effektiv den parazellulären Raum in den Monolayern, was zu einer intakten Barriere führt. Diese Studie beschreibt einen LY-basierten Fluoreszenz-Assay, der zur Bestimmung seinesscheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) verwendet werden kann und wiederum verwendet werden kann, um die Kinetik der Bildung von konfluenten Monolayern und die daraus resultierende enge Kreuzung zu bestimmen. Barriereintegrität in hCMEC/D3-Monolayern. Darüber hinaus zeigen wir einen zusätzlichen Nutzen dieses Assays, um die funktionelle Integrität von TJ in transfizierten Zellen zu bestimmen. Unsere Daten aus dem LY P App-Test zeigen, dass die hCMEC/D3-Zellen, die in einem Transwell-Setup gesät wurden, den LY-Parazelltransport effektiv auf 7 Tage nach der Kultur beschränken. Als zusätzlichen Nutzen des vorgestellten Tests zeigen wir auch, dass die DNA-Nanopartikeltransfektion den LY-Parazelltransport in hCMEC/D3-Monolayern nicht verändert.
Introduction
Blut – Hirn-Schranke (BBB) ist die Schutzbarriere, die den Zustrom von Plasmakomponenten in das Gehirngewebe begrenzt und besteht aus Hirn-Endothelzellen zusammen mit unterstützenden Zellen wie Pericyten. Die Hauptrolle von BBB ist es, als Barriere zu dienen, die den Raum zwischen peripherem Blut und zentralem Nervensystem (ZNS) versiegelt, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung1,2zu erhalten. Die Hirnkapillaren-Endothelzellen versiegeln den parazellulären Weg effektiv durch Bildung interzellulärer enger Verbindungen (TJs)1. Diese Schutzbarriere ermöglicht glukose und ausgewählte Nährstoffe in das Gehirn zu gelangen, während es verhindert, dass die Mehrheit der Ionen, toxische Substanzen und Medikamente durch diese enge Barriere passieren. Neben ihrer Schützenrolle stellt die natürliche Barrierefunktion des BBB eine große Herausforderung bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen dar, die auf das ZNS abzielen.
In-vitro-Zellkulturmodelle der BBB sind hilfreiche Werkzeuge, um ihre Biologie zu studieren und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Integrität der TJ-Barriere zu verstehen. Wir verwendeten die menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzelllinie (hCMEC/D3) als In-vitro-Modell, da es sich um ein akzeptiertes Modell des menschlichen Gehirnendothel3 handelt und viele Funktionen des menschlichen BBB rekapituliert. hCMEC/D3ist eine der am häufigsten verwendeten Zelllinien für die Modellierung der BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Trotz ihrer vergleichsweise niedrigen Werte des transendotheliaalen elektrischen Widerstands (TEER), einem Maß für die Dichtheit der Barriere, behält diese Zelllinie die meisten morphologischen und funktionellen Eigenschaften von Hirnendothelzellen bei, selbst als Monokultur kokultivierte Gliazellen6,7. Die hCMEC/D3-Zelllinie drückt mehrere BBB-Marker einschließlich aktiver Transporter und Rezeptoren bis etwa Durchgang 35 aus, ohne eine Dedifferenzierung zu instabilen Phänotypen6,7,9 ,10,11. Das auffälligste Merkmal der hCMEC/D3-Zelllinie als In-vitro-BBB-Modell ist ihre Fähigkeit, TJs5,9,11,12zu bilden. Es sollte beachtet werden, dass, obwohl Stammzellen-abgeleitete BBB-Modelle in vielen Studien eine höhere Permeabilität zeigten als hCMEC/D3-Zelllinieund sie einige BBB-Marker ausdrücken, sie sich aber noch als das häufigste BBB-Zellmodell entwickeln 13 . Wichtig ist, dass stammzellenabgeleitete BBB-Modelle in Bezug auf maximale Durchgangszahlen gekennzeichnet werden müssen, die es den Zellen ermöglichen, stabile BBB-Phänotypen zu erhalten14.
Drei primäre Methoden werden häufig verwendet, um die Integrität der TJ-Barriere zu bestimmen,einschließlich der Messung von TEER, Messung des scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (P-App) von kleinen hydrophilen Tracermolekülen wie Saccharose, Inulin, Luzifergelb, usw. und Immunfärbung bekannter molekularer Marker von TJs wie claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER ist eine relativ einfache und quantitative Methode, die den elektrischen Widerstand über die Zellmonolayer misst, die auf einem porösen Membransubstrat kultiviert sind5. TEER-Werte können jedoch durch experimentelle Variablen wie die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Art des Messinstruments beeinflusst werden. Eine wahrscheinliche Kombination dieser Faktoren führt zu einer breiten Verteilung der TEER-Werte von 2 bis 1150 cm2 in der hCMEC/D3-Zelllinie, die für 2-21 Tage kultiviert wurde13. Immunostaining ist eine visuelle Methode, um das Vorhandensein von TJ-Proteinen zu bestimmen, indem das zielgerichtete Protein mit Antikörpern gekennzeichnet wird. Immunstaining beinhaltet jedoch eine Reihe von experimentellen Schritten, einschließlich der Notwendigkeit, Zellen zu fixieren/permeabilisieren, die zu experimentellen Artefakten führen können und die fluoreszierenden Signale können im Laufe der Zeit verblassen. Die oben genannten Faktoren können zu subjektiven Fehlern führen, die sich auf die Datenqualität auswirken.
Der Hauptfokus dieser Arbeit liegt auf der Präsentation eines LY-basierten scheinbaren Permeabilitäts-Assays, der die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen bestimmt. Obwohl andere fortschrittliche In-vitro-BBB-Systeme, wie Co-Kultursysteme, mikrofluidische Systeme, physiologisch relevantere Mimik mit deutlich verbesserter Barrierefunktion15,16,17, das hCMEC/D3 sind transwell Setup ist ein einfaches und zuverlässiges Modell, um die Kinetik der TJ-Bildung zu schätzen und schnell die Wirkung verschiedener Arzneimittelformulierungen auf die Barrierefunktion abzuschirmen. Im Allgemeinen sind die P-App-Werte für verschiedene hydrophile Solutes in hCMEC/D3-Monolayern konsistent. Beispielsweise sind die gemeldeten P-App-Werte für verschiedene niedermolekulare Massensolutes (z. B. Saccharose, Mannitol, LY, etc.) in verschiedenen In-vitro-BBB-Modellen in der Größenordnung von 10-4 cm/min5,18,19 , 20. In unserem Versuchsaufbau werden die Endothelzellen des Gehirns auf einer kollagenbeschichteten mikroporösen Membran zur Zellanhaftung und Monolayerbildung gesät, um die In-vivo-Barriere nachzuahmen. Es wird erwartet, dass die in der apikalen Seite hinzugefügte LY die interzellulären engen Knoten durchqueren und sich in der basolateralen Seite ansammeln. Größere Konzentrationen von LY in der basolateralen Seite deuten auf eine unreife, nicht voll funktionsfähige Barriere hin, während niedrigere Konzentrationen einen eingeschränkten Transport aufgrund des Vorhandenseins funktioneller TJs widerspiegeln, was zu einer ausgereiften Barriere führt.
LY ist ein hydrophiler Farbstoff mit ausgeprägten Anregungs-/Emissionsspitzen und vermeidet die Notwendigkeit, Tracermoleküle wie Saccharose, Mannitol oder Inulin radioaktiv zu beschriften. So können die Fluoreszenzwerte von LY verwendet werden, um seine parazelluläre Permeabilität über die BBB-Monolayer direkt zu berechnen. Im Vergleich zu vielen kommerziell erhältlichen Farbstoffen, die in biomedizinischen Bereichen verwendet werden, die unter kleinen Stokes-Schichten wie Fluorescein21leiden, beträgt die Stokes-Verschiebung von LY etwa 108 nm mit ausreichender spektraler Trennung, so dass LY-Fluoreszenzdaten als robustes Auslesen zur Bestimmung der parazellulären Durchlässigkeit. Wir verwendeten Western Blotting als orthogonale Technik, um Veränderungen in der Expression des engen Knotenmarkerproteins ZO-1 im Laufe der Kulturzeit zu demonstrieren. ZO-1-Expression, die über Western Blotting erkannt wird, wird verwendet, um die LY P-App-Daten zu ergänzen, und in Kombination deuten diese Daten darauf hin, dass die beobachteten Veränderungen der LY P-App-Werte die Bildung einer Monolayer mit allmählicher Ausdruck der engen Anschlussmarkierung ZO-1.
Wie bereits erwähnt, liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit darin, einen LY-Assay als einfache Technik zur Überwachung der Bildung einer konfluenten Monoschicht mit funktionellen engen Knoten zu demonstrieren. Um jedoch einen zusätzlichen Nutzen des entwickelten Tests zu demonstrieren, haben wir die LY PApp in DNA-Nanopartikel-transfizierten hCMEC/D3-Monolayern gemessen. Nukleinsäuren können durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Polymergruppen und den negativ geladenen Phosphatgruppen von Nukleinsäuren 22 zu Polyelektrolyt-Nanopartikeln kondensiert werden22, 23. Wir bezeichnen diese Komplexe in unserer Arbeit als DNA-Nanopartikel (DNA-NPs). Während wir die Zelle transfetieren und das gewünschte Protein ausdrücken wollen, müssen wir sicherstellen, dass die Barriereeigenschaften der hCMEC/D3-Monolayer nicht beeinträchtigt werden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass ein standard4 h luziferase Gentransfektionsregime die LY-Permeabilität nicht messbar verändert, die den Nutzen des LY P App-Assays demonstriert, um Veränderungen in der TJ-Barriereintegrität zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Schlüsselrolle des BBB besteht darin, den Austausch von nicht essentiellen Ionen und toxischen Substanzen zwischen der systemischen Zirkulation und dem Gehirn zu verhindern, um die Hämostase der neuronalen Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Eines der charakteristischen Merkmale des BBB ist die Fähigkeit der Kapillaren-Endothelzellen, enge Knoten (TJs) zu bilden, die den parazellulären Transportweg effektiv versiegeln. Wir demonstrierten einen LY P App-Assay als quantitative Methode zur Bestimmung der s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch den New Investigator Award 2017 der American Association of Pharmacy, einen Hunkele Dreaded Disease Award der Duquesne University und die School of Pharmacy Start-up-Fonds für das Manickam-Labor. Wir möchten dem Leak-Labor (Duquesne University) für die Unterstützung durch western Blotting danken und die Verwendung ihres Odyssey 16-Bit-Imagers ermöglichen. Wir möchten auch eine besondere Dankesnote für Kandarp Dave (Manickam Labor) für die Hilfe bei western blotting.
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
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