루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커
Summary
우리는 루시퍼 옐로우 (LY)가 hCMEC/D3 세포 단층의 명백한 paracellular 투과성을 결정하는 강력한 마커, 인간 혈액 뇌 장벽의 체외 모델임을 입증하기 위해 형광 분석방법을 제시합니다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하기 위해이 분석기를 사용했습니다.
Abstract
혈액-뇌 장벽 BBB 는 비필수 이온및 독성 물질의 교환을 방지하기 위해 전신 순환과 뇌 사이의 장벽을 형성하는 내피 세포로 구성됩니다. 단단한 접합부(TJ)는 단층의 파라셀룰러 공간을 효과적으로 밀봉하여 손상되지 않은 장벽을 생성합니다. 본 연구는 명백한 투과성 계수(P 앱)를 결정하는 데 사용될 수 있는 LY기반 형광 분석(P app)을 설명하고, 그 결과로 인한 단층 형성의 역학을 결정하는 데 사용될 수 있다. hCMEC/D3 단층의 장벽 무결성. 우리는 또한 형질감염된 세포에 있는 TJ 기능 무결성을 결정하기 위하여 이 분석의 추가 유용성을 보여줍니다. LY P앱 분석에서 우리의 데이터는 트랜스웰 설정에서 시드된 hCMEC/D3 세포가 LY 파라셀룰러 수송을 효과적으로 제한한다는 것을 보여준다 7 일 포스트 배양. 제시된 분석의 추가 유틸리티로서, 우리는 또한 DNA 나노 입자 형질감염이 hCMEC/D3 단층에서 LY 파라세포 수송을 변경하지 않는다는 것을 입증한다.
Introduction
혈액-뇌 장벽 (BBB) 뇌 조직에 플라즈마 구성 요소의 유입을 제한 하는 보호 장벽 이며 pericytes 같은 지원 세포와 함께 뇌 내 피 세포로 구성. BBB의 주요 역할은 말초 혈액과 중추 신경계(CNS) 사이의 공간을 밀봉하여 신경 미세 환경의 지혈을 유지하는 장벽역할을한다1,2. 뇌 모세관 내피 세포효과적으로 세포 간 단단한 접합부 (TJs)의 형성을통해 paracellular 통로를 밀봉 1. 이 보호 장벽은 포도당과 선택한 영양소가 뇌에 들어가는 것을 허용하며 대부분의 이온, 독성 물질 및 약물이 이 단단한 장벽을 통과하는 것을 방지합니다. BBB의 보호 역할 외에도, BBB의 자연 장벽 기능은 CNS를 대상으로 하는 약물 전달 시스템 개발에 심각한 도전을 제기합니다.
BBB의 체외 세포 배양 모델은 생물학을 연구하고 TJ 장벽 무결성에 대한 약물 치료의 효과를 이해하는 데 유용한 도구입니다. 우리는 인간 뇌 내피 의 허용 모델이기 때문에 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포주 (hCMEC / D3)를 시험관 내 모델로 사용3 인간 BBB의 많은 기능을 재현. hCMEC/D3is 는 시험관 내 BBB 모델링에 가장 일반적으로사용되는 세포주 중 하나 이며, 5, 5,6,7,8,9. 피질 전기 저항의 비교적 낮은 값에도 불구하고 (TEER), 장벽 압박감의 측정, 이 세포주는 뇌 내피 세포의 형태학적 및 기능적 특성의 대부분을 유지, 심지어의 부재에서 단일 배양으로 교양 세포6,7. hCMEC/D3 세포주 들은 불안정한 표현형6,7,9에 대한 분화를 거치지 않고 대략 통로 35까지 활성 수송기 및 수용체를 포함한 다중 BBB 마커를 발현합니다. ,10,11. 체외 BBB 모델로 hCMEC/D3 세포주의 가장 눈에 띄는 특징은 TJs5,9,11,12를형성하는 능력입니다. 줄기 세포 유래 BBB 모델은 hCMEC/D3 세포주와 비교하여 많은 연구에서 더 높은 투과성을 보였고 일부 BBB 마커를 발현하지만, 그들은 아직 가장 일반적인 BBB 세포 모델13으로진화하지 못하고 있다는 점에 유의해야 한다. 중요하게도, 줄기세포 유래 BBB 모델은 세포가 안정적인 BBB 표현형을 유지할 수 있도록 하는 최대 통로 수에 대하여 특징지어지도록 남아있다 14.
세 가지 주요 방법은 일반적으로 TER의 측정, 자당, 이눌린, 루시퍼 옐로우와같은 작은 친수성 추적자 분자의 명백한 투과성 계수(P app)의 측정을 포함하여 TJ 장벽 무결성을 결정하는 데 일반적으로 사용되며, 클라딘-5, ZO-1, 옥클루딘 등과 같은 TJs의 공지된 분자 마커의면역 염색 등 5. TEER는 다공성 멤브레인 기판에서배양된 세포 단층 전반에 걸쳐 전기 저항을 측정하는 비교적 간단하고 정량적인 방법 5. 그러나 TEER 값은 배양 배지의 조성 및 측정 기기의 유형과 같은 실험 변수에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 요인의 가능성이 조합은 2-21일 동안 배양된 hCMEC/D3 세포주에서 2~1150Ω cm2에 이르는 TEER 값의 광범위한 분포를 13일 동안 이끈다. 면역염색은 항체를 사용하여 표적 단백질에 라벨을 붙임으로써 TJ 단백질의 존재를 결정하는 시각적 방법이다. 그러나, 면역 염색은 실험적인 유물 귀착될 수 있는 세포를 고치고 침투할 필요를 포함하여 일련의 실험 단계를 관련시키고 형광 신호는 시간이 지남에 따라 퇴색할 수 있습니다. 위의 요인으로 인해 데이터 품질에 영향을 미치는 주관적인 오류가 발생할 수 있습니다.
이 작업의 주요 초점은 LY 기반 명백한 투과성 분석이 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하는 것입니다. 공동 배양 시스템, 미세 유체 시스템과 같은 다른 고급 시험관 내 BBB 시스템은 생리적으로 더 관련성이 높지만 장벽 기능15,16,17,hCMEC/D3 transwell 설정은 TJ 형성의 역학을 추정하고 신속하게 장벽 기능에 다른 약물 제형의 효과를 스크리킹하는 간단하고 신뢰할 수있는 모델입니다. 일반적으로 P앱 값은 hCMEC/D3 단층의 다양한 친수성 용정에 대해 일관됩니다. 예를 들어, 다양한 저분자 질량 용출체(예: 자당, 만니톨, LY 등)에 대한 보고된 P앱 값은 상이한 시험관 내 BBB 모델에서 10-4 cm/min 5,18,19의 순서로 , 20. 우리의 실험 설정에서, 뇌 내피 세포는 생체 내 장벽을 모방하는 세포 부착 및 단층 형성을위한 콜라겐 코팅 미세 다공성 멤브레인에 시드된다. 정점 측에 첨가된 LY는 세포간 단단한 접합을 통과하고 basolateral 측에 축적될 것으로 예상된다. basolater측에서 LY의 더 큰 농도는 미성숙하고 완전하지 않은 기능 장벽을 나타내고 낮은 농도는 성숙한 장벽의 결과로 기능성 TJ의 존재로 인해 제한된 수송을 반영합니다.
LY는 뚜렷한 여기/방출 피크를 가진 친수성 염료이고 자당, 만니톨 또는 이눌린과 같은 추적자 분자를 방사성 표지하는 필요를 방지합니다. 따라서, LY의 형광 값은 BBB 단층전반에 걸쳐 의 파라셀룰러 투과성을 직접 계산하는데 사용될 수 있다. 또한, 형광과 같은 작은 스토크스 교대로 고통받는 생물 의학 분야에서 사용되는 많은 상용염료와 비교하여, LY의 스토크스 시프트는 충분한 스펙트럼 분리를 가진 약 108 nm이며, 따라서 LY 형광 데이터를 강력한 판독을 통해 파라셀룰러 투과성을 결정합니다. 우리는 접합 마커 단백질, ZO-1의 발현의 변화를 보여주기 위해 직교 기술로 서양 블로팅을 사용했습니다. 서양 블로팅을 통해 검출된 ZO-1 발현은 LY P앱 데이터를 보충하는 데 사용되며, 이러한 데이터는 LY P앱 값의 관찰된 변화가 점진적인 증가와 함께 단층의 형성을 반영한다는 것을 시사한다. 타이트 한 접합 마커, ZO-1의 표현.
앞서 지적했듯이, 이 작업의 중심은 기능적 단단한 접합부가 있는 결합단층의 형성을 모니터링하는 간단한 기법으로서 LY 분석법을 입증하는 것이다. 그러나, 개발된 분석법의 추가적인 유용성을 입증하기 위해, 우리는 DNA 나노입자 형질감염된 hCMEC/D3 단층에서 LY P앱을 측정했다. 핵산은 중합체의 양전하 그룹과 음전하인 인산의 중화기 그룹(22) 사이의 정전기 적 상호 작용을 통해 직경 100-200nm의 다연화 나노 입자로 응축 될수있다. 23. 우리는 이 복합체를 우리의 일에서 DNA 나노 입자 (DNA NPs)로 지칭합니다. 우리의 의도는 세포를 트랜스펙트하고 원하는 단백질을 표현하는 것이지만, 우리는 hCMEC/D3 단층의 장벽 특성이 손상되지 않도록 해야 합니다. 우리의 데이터는 표준 4 시간 luciferase 유전자 형질감염 정권이 TJ 장벽 무결성에 있는 변경을 결정하기 위하여 LY Papp 분석의 유용성을 입증하는 LY 투과성을 측정가능하게 바꾸지 않는다는 것을 건의합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
BBB의 주요 역할은 신경 미세 환경의 지혈을 유지하기 위해 전신 순환과 뇌 사이의 비 필수 이온 및 독성 물질의 교환을 방지하는 것입니다. BBB의 특징적인 특징 중 하나는 모세관 내피 세포가 수송의 파라셀룰러 경로를 효과적으로 밀봉하는 단단한 접합부(TJs)를 형성하는 능력이다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 단층에서 TJ 장벽 형성의 명백한 역학을 결정하는 정량적 방법으로 LY P앱 분석법을 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 약국의 미국 협회에서 2017 새로운 조사자 상, Duquesne 대학에서 Hunkele 공포 질병 상과 Manickam 실험실에 대한 약학 창업 기금의 학교에서 재정 지원에 감사드립니다. 우리는 서부 블로팅 지원과 오디세이 16 비트 이미저의 사용을 허용 누출 실험실 (Duquesne 대학)에 감사드립니다. 우리는 또한 칸다프 데이브 (Manickam 실험실)에 대한 감사의 특별한 메모를 포함하고 싶습니다 서부 블로팅에 대한 도움.
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
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