Lucifero Giallo - Un Robusto Indicatore di Permeabilità Paracellulare in un Modello Cellulare della Barriera Sangue-Cervello Umano
Summary
Presentiamo un saggio di fluorescenza per dimostrare che Lucifero Giallo (LY) è un marcatore robusto per determinare l’apparente permeabilità paracellulare dei monostrati cellulari hCMEC/ D3, un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana. Abbiamo usato questo saggio per determinare la cinetica di una formazione di monostrato confluente nelle cellule hCMEC/D3 coltivate.
Abstract
La barriera emato-encefalica BBB è costituita da cellule endoteliali che formano una barriera tra la circolazione sistemica e il cervello per impedire lo scambio di ioni non essenziali e sostanze tossiche. Giunzioni strette (TJ) sigillano efficacemente lo spazio paracellulare nei monostrati, causando una barriera intatta. Questo studio descrive un saggio di fluorescenza basato su LY che può essereutilizzato per determinare il suo coefficiente di permeabilità apparente (P app) e a sua volta può essere utilizzato per determinare la cinetica della formazione di monostrati confluenti e la risultante giunzione stretta risultante l’integrità della barriera nei monostrati hCMEC/D3. Dimostriamo inoltre un’utilità aggiuntiva di questo saggio per determinare l’integrità funzionale di TJ nelle cellule trasfette. I nostri dati dal saggiodell’app LY P mostrano che le cellule hCMEC/D3 seminato in una configurazione transwell limitano efficacemente il trasporto paracellulare LY 7 giorni dopo la coltura. Come utilità aggiuntiva del saggio presentato, dimostriamo anche che la trasfezione delle nanoparticelle di DNA non altera il trasporto paracellulare LY nei monostrati hCMEC/D3.
Introduction
La barriera emato-encefalica (BBB) è la barriera protettiva che limita l’afflusso di componenti plasmatici nel tessuto cerebrale ed è costituita da cellule endoteliali cerebrali insieme a cellule di supporto come i periciti. Il ruolo principale di BBB è quello di fungere da barriera che sigilla lo spazio tra il sangue periferico e il sistema nervoso centrale (SNC) per mantenere l’emostasi del microambiente neurale1,2. Le cellule endoteliali capillari del cervello sigillano efficacemente la via paracellulare attraverso la formazione di giunzioni strette intercellulari (TJ)1. Questa barriera protettiva consente al glucosio e ai nutrienti selezionati di entrare nel cervello mentre impedisce alla maggior parte degli ioni, sostanze tossiche e farmaci di passare attraverso questa barriera stretta. Oltre al suo ruolo protettivo, la funzione di barriera naturale della BBB rappresenta una grave sfida nello sviluppo di sistemi di somministrazione di farmaci rivolti al SNC.
I modelli di coltura cellulare in vitro del BBB sono strumenti utili per studiare la sua biologia e per comprendere gli effetti del trattamento farmacologico sull’integrità delle barriere TJ. Abbiamo usato la linea cellulare endoteliale cerebrale cerebrale (hCMEC/D3) come modello in vitro poiché è un modello accettato di endotelio cerebrale umano3 e riassume molte funzioni del BBB umano. hCMEC/D3 è una delle linee cellulari più comunemente utilizzate per la modellazione del BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Nonostante i suoi valori relativamente bassi di resistenza elettrica transeteliale (TEER), una misura di tenuta della barriera, questa linea cellulare mantiene la maggior parte delle proprietà morfologiche e funzionali delle cellule endoteliali cerebrali, anche come monocoltura in assenza di cellule gliali coculture6,7. La linea cellulare hCMEC/D3 esprime più marcatori BBB, compresi trasportatori attivi e recettori fino al passaggio 35 circa senza subire la dedifferenziazione ai fenotipi instabili6,7,9 ,10,11. La caratteristica più sorprendente della linea cellulare hCMEC/D3 come modello BBB in vitro è la sua capacità di formare TJ5,9,11,12. Va notato che, sebbene i modelli BBB derivati da cellule staminali abbiano mostrato una maggiore permeabilità in molti studi rispetto alla linea cellulare hCMEC/D3 e esprimano alcuni marcatori BBB, devono ancora evolversi come il modello cellulare BBB più comune13. È importante sottolineare che i modelli BBB derivati dalle cellule staminali devono essere caratterizzati rispetto ai numeri massimi di passaggio che consentono alle cellule di mantenere i fenotipi BBB stabili14.
Tre metodi primari sono comunemente utilizzati per determinare l’integrità della barriera TJ,compresa la misurazione del TEER, la misurazione del coefficiente di permeabilità apparente (P app) di piccole molecole di tracciante idrofilo come il saccarosio, l’inulina, il giallo di Lucifero, ecc. e immunostaining di marcatori molecolari noti di TJ come claudin-5, zo-1, occludina, ecc5. TEER è un metodo relativamente semplice e quantitativo che misura la resistenza elettrica attraverso i monostrati cellulari coltivati su un substrato di membrana porosa5 . Tuttavia, i valori TEER possono essere influenzati da variabili sperimentali come la composizione del mezzo di coltura e il tipo di strumento di misurazione. Una probabile combinazione di questi fattori porta ad un’ampia distribuzione dei valori di TEER che vanno da 2 a 1150 cm2 nella linea cellulare hCMEC /D3 coltivata per 2-21 giorni13. L’immunostaining è un metodo visivo per determinare la presenza di proteine TJ etichettando la proteina mirata utilizzando anticorpi. Tuttavia, l’immunostaining comporta una serie di passaggi sperimentali, tra cui la necessità di fissare/permeabilizzare le cellule che possono provocare artefatti sperimentali e i segnali fluorescenti possono svanire nel tempo. I fattori di cui sopra possono portare a errori soggettivi che influiscono sulla qualità dei dati.
L’obiettivo principale di questo lavoro è quello di presentare un saggio di permeabilità apparente basata su LY determinare la cinetica di una formazione di monostrato confluente in cellule hCMEC/D3 coltivate. Sebbene altri sistemi BBB in vitro avanzati, come i sistemi di cocoltura, i sistemi microfluidici, siano imitazioni fisiologicamente più rilevanti con una funzione di barriera significativamente migliorata15,16,17, l’hCMEC/D3 l’installazione del transwell è un modello semplice e affidabile per stimare la cinetica della formazione di TJ e selezionare rapidamente l’effetto di diverse formulazioni farmacologiche sulla funzione di barriera. In generale, i valoridell’app P sono coerenti per vari soluti idrofili nei monostrati hCMEC/D3. Ad esempio, i valori diApp P segnalati per vari soluti di massa molecolare bassa (come saccarosio, mannitolo, LY, ecc.) in diversi modelli BBB in vitro sono nell’ordine di 10-4 cm/min5,18,19 , 20.Nella nostra configurazione sperimentale, le cellule endoteliali cerebrali vengono semiate su una membrana micropororosa rivestita di collagene per l’attaccamento cellulare e la formazione di monostrato per imitare la barriera in vivo. Il LY aggiunto nel lato apicale dovrebbe attraversare le giunzioni strette intercellulari e accumularsi nel lato basolaterale. Concentrazioni maggiori di LY nel lato basolaterale indicano una barriera immatura e non completamente funzionale, mentre concentrazioni più basse riflettono il trasporto limitato a causa della presenza di TJ funzionali con conseguente barriera matura.
LY è un tintura idrofilo con picchi di eccitazione/emissione distinti ed evita la necessità di radioetichettare molecole traccianti come saccarosio, mannitolo o inulina. Così, i valori di fluorescenza di LY possono essere utilizzati per calcolare direttamente la sua permeabilità paracellulare attraverso i monostrati BBB. Inoltre, rispetto a molti coloranti disponibili in commercio utilizzati in campi biomedici che soffrono di piccoli spostamenti Di Stokes come la fluoresceina21, lo spostamento di Stokes di LY è di circa 108 nm con sufficiente separazione spettrale, consentendo così i dati di fluorescenza LY come robusta lettura per determinare la permeabilità paracellulare. Abbiamo usato il gonfiore occidentale come tecnica ortogonale per dimostrare i cambiamenti nell’espressione della proteina del marcatore di giunzione stretta, o-1, nel tempo della coltura. L’espressione di O-1 rilevata tramite il gonfiore occidentale viene utilizzata per integrare i datidell’app LY P e, in combinazione, questi dati suggeriscono che i cambiamenti osservati nei valoridell’app LY P riflettono la formazione di un monostrato con un graduale aumento espressione del marcatore di giunzione stretto, .
Come sottolineato in precedenza, l’obiettivo centrale di questo lavoro è quello di dimostrare un saggio LY come una semplice tecnica per monitorare la formazione di un monostrato confluente con giunzioni strette funzionali. Tuttavia, per dimostrare un’ulteriore utilità del saggio sviluppato, abbiamo misuratol’app LY P in monostrati hCMEC/D3 trasaffetti da nanoparticelle di DNA. Gli acidi nucleici possono essere condensati in nanoparticelle polielettrolitiche con un diametro di 100-200 nm attraverso l’interazione elettrostatica tra i gruppi di polimeri caricati positivamente e i gruppi di fosfati caricati negativamente di acidi nucleici22, 23. Ci riferiamo a questi complessi come nanoparticelle di DNA (DNA NP) nel nostro lavoro. Mentre la nostra intenzione è quella di trasfecare le cellule ed esprimere la proteina desiderata, dobbiamo garantire che le proprietà della barriera dei monostrati hCMEC/D3 non siano compromesse. I nostri dati suggeriscono che un regime di trasfezione genica luciferasi standard di 4 h non cambia misurabilmente la permeabilità LY dimostrando l’utilità del saggiodell’app LY P per determinare i cambiamenti nell’integrità della barriera TJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un ruolo chiave della BBB è quello di impedire lo scambio di ioni non essenziali e sostanze tossiche tra la circolazione sistemica e il cervello per mantenere l’emostasi del microambiente neurale. Una delle caratteristiche del BBB è la capacità delle cellule endoteliane capillari di formare giunzioni strette (TJ) che sigillano efficacemente il percorso paracellulare di trasporto. Abbiamo dimostrato un saggiodell’app LY P come metodo quantitativo per determinare l’apparente cinetica della formazione della ba…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati per il sostegno finanziario dal 2017 New Investigator Award dall’American Association of Pharmacy, un hunkele Dreaded Disease award dalla Duquesne University e i fondi di start-up School of Pharmacy per il laboratorio Manickam. Ringraziamo il laboratorio Leak (Duquesne University) per l’assistenza occidentale del blotting e per aver permesso l’uso del loro imager A 16 bit Odyssey. Vorremmo anche includere una nota speciale di apprezzamento per Kandarp Dave (laboratorio Manickam) per l’aiuto con il gonfiore occidentale.
Materials
| hCMEC/D3 cell line | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | human cerebral microvascular endothelial cell line |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | Plasmid DNA encoding luciferase gene |
| lucifer yellow CH dilithium salt | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes | Falcon | 353095 | |
| Tissue culture flask | Olympus Plastics | 25-207 | |
| 24-well Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Black 96-Well Immuno Plates | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-minimum essential medium (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| phosphate-buffered saline 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Collagen Type I | Discovery Labware, Inc. | 354236 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Cell Culture Lysis 5X Reagent | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferin, Potassium Salt | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Molecular Devices | Fluorescence Plate Reader | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anti-GAPDH antibody | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12-well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-106 | |
| RIPA buffer (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | for scanning western blot membranes |
Referenzen
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery–In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
- Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
- Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650 (2007).
- Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. . The Blood-Brain Barrier. , 307-324 (2003).
- Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
- Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
- Couraud, P. O. . The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. , (2012).
- Youdim, K. u. r. e. s. h. A., A, A. A. a. N. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
- Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. , (1992).
- Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).
- Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).
- Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
- Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).
- Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
- Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
- Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).
- Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).
- Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).
