Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

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Genetik

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas es una tecnología de gran alcance para los complejos genomas de plantas y animales. Aquí detallamos un protocolo eficiente editar el genoma humano utilizando diferentes endonucleasas de Cas. Se destacan importantes consideraciones y parámetros de diseño para optimizar la eficiencia de la edición.

Abstract

El sistema regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) Cluster funciona naturalmente en bacteria inmunidad adaptativa, pero ha sido repurposed con éxito para la ingeniería del genoma de muchos organismos vivos diferentes. Comúnmente, el wildtype CRISPR asociados 9 (Cas9) o endonucleasa de Cas12a se utiliza para unirse a sitios específicos en el genoma, después de que la rotura de doble hebra de ADN se repara mediante la no homóloga se terminan uniendo (NHEJ) camino o la reparación dirigida de homología ( Camino HDR) dependiendo de si es una plantilla de donantes ausente o presente respectivamente. Hasta la fecha, sistemas CRISPR de diferentes especies bacterianas han demostrado ser capaces de realizar la edición del genoma en células de mamíferos. Sin embargo, a pesar de la aparente simplicidad de la tecnología, varios parámetros de diseño necesitan ser considerados, que a menudo dejan perplejos sobre la forma mejor para llevar a cabo su genoma experimentos de edición de usuarios. Aquí, describimos un completo flujo de trabajo de diseño experimental para identificación de clones de células que llevan a modificaciones de ADN deseados, con el objetivo de facilitar la ejecución exitosa del genoma edición experimentos en líneas celulares mamíferos. Destacamos consideraciones clave para los usuarios a tomar nota, incluyendo la elección del sistema CRISPR, la longitud del espaciador y el diseño de una plantilla de donantes oligodeoxynucleotide monocatenario (ssODN). Imaginamos que este flujo de trabajo será útil para estudios gene knockout, modelado de esfuerzos, la enfermedad o líneas celulares de la generación del reportero.

Introduction

La capacidad para diseñar el genoma de cualquier organismo vivo tiene muchas aplicaciones biomédicas y biotecnológicas, como la corrección de enfermedad-causar mutaciones, construcción de modelos celulares precisos estudios de la enfermedad, o generación de agrícola cultivos con características deseables. Puesto que la vuelta del siglo, se han desarrollado diversas tecnologías para la ingeniería del genoma en células de mamíferos, incluyendo meganucleases¹^,²^,³, zinc finger nucleasas⁴^,⁵, o transcripción efector activador como nucleasas (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Sin embargo, estas tecnologías anteriores son programa difícil o tedioso de montar, tal modo obstaculizando su adopción generalizada en la investigación y la industria.

En los últimos años, el cluster regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) – sistema CRISPR-asociado (Cas) se ha convertido en un genoma nuevo potente ingeniería tecnología¹⁰^,¹¹. Originalmente un sistema inmune adaptante en las bacterias, ha sido exitosamente implementado para la modificación del genoma en plantas y animales, incluyendo seres humanos. La razón principal por qué CRISPR-Cas ha ganado tanta popularidad en tan corto tiempo es el elemento que trae la clave endonucleasa de Cas, como Cas9 o Cas12a (también conocido como Cpf1), en la ubicación correcta en el genoma es simplemente una pequeña pieza de guía solo quimérica RN A (sgRNA), que es de diseño sencillo y barato sintetizar. Después de ser reclutado al sitio de destino, la enzima Cas funciona como un par de tijeras moleculares y hiende la DNA dependiente con su RuvC, HNH o Nuc dominios¹²^,¹³^,¹⁴. Posteriormente se repara la rotura trenzada doble resultante (de diferencias OSD) por las células a través de la vía de reparación dirigido por homología (HDR) o no homóloga se terminan uniendo (NHEJ). En la ausencia de una plantilla de reparación, el OSD es reparado por la vía NHEJ propenso, que puede dar lugar a pseudo-random inserción o deleción de nucleótidos (indels) en el sitio de corte, potencialmente causando mutágeno ‘ frameshift ‘ mutaciones en genes de la proteína-codificación. Sin embargo, en presencia de una plantilla de donante que contiene los cambios de ADN deseados, el OSD es reparado por la vía HDR de alta fidelidad. Tipos comunes de donantes plantillas son oligonucleótidos de cadena simple (ssODNs) y plásmidos. El primero se utiliza normalmente si los cambios previstos de DNA son pequeños (por ejemplo, alteración de un solo par de base), mientras que este último se suele utilizar si se desea insertar una secuencia relativamente larga (por ejemplo, la secuencia de codificación de una proteína verde fluorescente o GFP) en el lugar de destino.

La actividad endonucleasa de la proteína Cas requiere la presencia de un motivo adyacente de protospacer (PAM) en el sitio de destino¹⁵. PAM de Cas9 es el extremo 3′ de la protospacer, mientras que el PAM de Cas12a (también llamado Cpf1) está en el extremo 5′ en lugar¹⁶. La guía de Cas RNA complejo es incapaz de introducir un OSD si el PAM es ausente¹⁷. Por lo tanto, el PAM coloca una restricción en las localizaciones genómicas donde una nucleasa Cas particular es capaz de unirse. Afortunadamente, las nucleasas de la Cas de diferentes especies bacterianas típicamente exhiben diversos requisitos de PAM. Por lo tanto, al integrar varios sistemas de CRISPR-Cas en nuestra caja de herramientas de ingeniería, podemos ampliar la gama de sitios que pueden ser objeto de un genoma. Además, una enzima natural de la Cas puede ser diseñado o evolucionado para reconocer secuencias de PAM alternativas, ampliando aún más el alcance de objetivos genómicas accesibles a la manipulación¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Aunque varios sistemas CRISPR-Cas están disponibles para propósitos de ingeniería del genoma, la mayoría de usuarios de la tecnología ha dependido principalmente la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) por múltiples razones. En primer lugar, requiere un PAM relativamente simplemente NGG, a diferencia de muchas otras proteínas de Cas que pueden unirse sólo en presencia de PAM más compleja. En segundo lugar, es la primera endonucleasa de Cas a ser implementado con éxito en células humanas²¹^,²²^,²³^,²⁴. En tercer lugar, SpCas9 es la enzima mejor caracterizada hasta la fecha. Si un investigador desea utilizar otro nucleasa de Cas, él o ella a menudo sería confusa acerca de la mejor manera de diseñar el experimento y así otras enzimas llevará a cabo en diferentes contextos biológicos comparados con SpCas9.

Para dar claridad al desempeño relativo de los diferentes sistemas de CRISPR-Cas, recientemente hemos realizado una comparación sistemática de cinco endonucleases de Cas-SpCas9, la enzima Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9), la enzima Cas9 de Meningitidis de la Neisseria (NmCas9), la enzima Cas12a de Acidaminococcus SP. BV3L6 (AsCas12a) y la enzima Cas12a de Lachnospiraceae bacteria ND2006 (LbCas12a)²⁵. Para una comparación justa, se evaluaron las diversas nucleasas Cas mediante el mismo conjunto de sitios de destino y otras condiciones experimentales. Los parámetros de diseño del estudio también delineado para cada sistema CRISPR-Cas, que serviría como una referencia útil para los usuarios de la tecnología. Aquí, mejor permiten a los investigadores a hacer uso de la Cas CRISPR sistema, proporcionamos un protocolo paso a paso para la ingeniería del genoma óptima con los distintos enzimas Cas9 y Cas12a (ver figura 1). El Protocolo no sólo incluye detalles experimentales pero también importantes consideraciones para maximizar la probabilidad de un resultado de ingeniería exitosa del genoma en células de mamíferos.

Figura 1 : Una visión general del flujo de trabajo para generar el genoma editado líneas celulares humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. diseño de sgRNAs Seleccionar un sistema apropiado de CRISPR-Cas. En primer lugar, inspeccionar la región de destino para las secuencias de PAM de nucleasas Cas9 y Cas12a todos que han demostrado ser funcionales en células de mamífero16,21-32. Cinco enzimas utilizadas figuran en la tabla 1 junto con sus respectivas PAMs.Nota: además de las endonucleasas enumerados en la tabla 1, existen otras enzimas Cas menos comunes que han sido implementados con…

Representative Results

Para llevar a cabo un genoma edición experimento, un plásmido CRISPR expresando un sgRNA dirigidas al que locus de interés necesita ser clonado. En primer lugar, el plásmido se digiere con una enzima de restricción (típicamente un tipo de enzima de IIs) para alinearlo. Se recomienda resolver el producto digerido en un gel de agarosa al 1% junto a un plásmido no digerida para distinguir entre una digestión completa y parcial. Como los plásmidos digeridos son superenrollados, tienden a correr más rápido que sus …

Discussion

El sistema CRISPR-Cas es una potente y revolucionaria tecnología diseñar genomas los transcriptomas de plantas y animales. Numerosas especies bacterianas se han encontrado para contener sistemas CRISPR-Cas, que potencialmente pueden ser adaptados para el genoma y transcriptoma ingeniería propósitos⁴⁴. Aunque la endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) fue la primera enzima a implementarse con éxito en células humanas²¹^,<sup class="xref"…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. es apoyada por una agencia para la concesión de oficina conjunta del Consejo de ciencia, tecnología y de investigación (1431AFG103), un Consejo de investigación médica nacional conceder (OFIRG/0017/2016), otorga la Fundación Nacional de investigación (NRF2013-THE001-046 y NRF2013-THE001-093), un Subvención del Ministerio de educación nivel 1 (RG50/17 (S)), una startup becado por Universidad Tecnológica de Nanyang y fondos para la competencia internacional genéticamente máquina de la ingeniería (iGEM) de la Universidad Tecnológica de Nanyang.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

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Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).