Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Bau einer Zelle Kultur Kammer entwickelt, um Zellen zu verschiedenen Arten von elektrische Stimulation, und seine Verwendung bei der Behandlung von mesenchymalen Stammzellen zur Verbesserung der osteogene Differenzierung aufzudecken.
Abstract
Mesenchymale Stammzellen/Stromazellen Zellen (MSCs) wurden ausgiebig zur Förderung der Knochenheilung in Gewebetechnik Ansätze. Elektrostimulation (EStim) nachweislich zu erhöhen MSC osteogene Differenzierung in-vitro- und Förderung der Knochenheilung in klinischen Umgebungen. Hier beschreiben wir den Bau einer EStim Zelle Kultur Kammer und seine Verwendung bei der Behandlung von Ratte Bone-Marrow-derived MSC osteogene Differenzierung zu verbessern. Wir fanden, dass die Behandlung von MSCs mit EStim für 7 Tage führt zu einem deutlichen Anstieg der osteogene Differenzierung, und wichtig ist, diese Pro-osteogene Effekt bleibt lange nach (7 Tage) EStim eingestellt ist. Dieser Ansatz der Vorbehandlung MSCs mit EStim osteogene Differenzierung verbessern ließe sich Knochengewebe engineering Behandlungsergebnisse zu optimieren und so helfen ihnen, ihre volle therapeutische Potential zu erreichen. Neben dieser Anwendung dieser EStim Zelle Kultur Kammer und Protokoll auch einsetzbar, andere EStim-sensible Zelle Verhaltensweisen, z. B. Migration, Proliferation, Apoptose und Gerüst Anlage zu untersuchen.
Introduction
Zunahme/Trauma oder Krankheit-induzierte Knochendefekte sind mit unterschiedlichen Kombinationen der Zelltherapie und regenerative Medizin-Technologien behandelt werden. MSCs sind die Zelle der Auswahl in solche Behandlungen aufgrund ihrer relativ hohen knochenbildenden Aktivität, Isolierung und Ausbau Effizienz und Sicherheit1. Zur Maximierung ihrer knochenbildenden Aktivität und damit ihre therapeutische Wirksamkeit zu optimieren, wurden mehrere Methoden eingeführt, um MSCs vor ihrer Verwendung in diesen Behandlungen zu manipulieren (wie Mauney Et Al.2überprüft). Eine solche Methode ist EStim, das gezeigt worden ist, zu verbessern MSC osteogene Differenzierung in Vitro3 und Förderung der Knochenheilung in-vivo-4. Trotz der wachsenden Zahl von Studien mit Schwerpunkt auf die Behandlung von MSCs mit EStim muss eine optimale Therapie für die Maximierung der EStim Pro-osteogene Effekt noch definiert werden.
Andere in-vitro-Methoden mit EStim nutzen Salz Brücken, eingetaucht in das Kulturmedium, das Zellen von metallischen Elektroden5trennt. Der Vorteil hierbei ist, dass liefern EStim durch Salz Brücken die Einführung der chemischen Nebenprodukte (z.B. Korrosion von metallischen Elektroden) eliminiert, die zytotoxischen möglicherweise. Trotz dieses Vorteils Salz Brücken sind umständlich, mit zu arbeiten, und die EStim sie liefern unterscheidet, dass gelieferte in in-vivo-Modelle macht es schwierig, die Ergebnisse beim Einsatz der beiden Systeme korrelieren. Setups, die EStim über metallische oder Carbon Elektroden befestigt im Inneren der Zelle Kultur Brunnen liefern simulieren (wie Hronik Tupaj und Kaplan6überprüft) besser Geräte in Vivo; aber diese Geräte sind schwer zu reinigen sterilisieren/zwischen den Anwendungen und beschränkt sich die Anzahl der Zellen, die pro Experiment untersucht werden können. Wir entwarfen EStim Kammer präsentiert hier speziell um die Einschränkungen von diesen anderen Setups zu beheben. Während die meisten von unserer Erfahrung im Umgang mit diesem EStim-Saal wurde mit 2D und 3D Kulturen mit dem Knochenmark und Fettgewebe-Gewebe-abgeleitete MSCs3,4, ein großer Vorteil dieses Hauses ist, dass es ist vielseitig und mit relativ Änderungen, anpassbar andere Zelltypen unter einer Vielzahl von unterschiedlichen Bedingungen zu studieren.
Hier beschreiben wir den Bau einer EStim Zelle Kultur Kammer; dann zeigen wir Ihnen deren Nutzung durch Behandlung von MSCs mit verschiedenen Therapien EStim und den daraus resultierende Effekt auf osteogene Differenzierung zu messen. MSC osteogene Differenzierung wird durch Ablagerung von Kalzium, alkalische Phosphatase-Aktivität und osteogene Marker-gen-Expression beurteilt. Vor allem beobachtet Vergangenheit Experimente, die diese Einrichtung verwendet wir, dass diese Pro-osteogene Effekte bestehen, lange nach Beendigung der Therapie die EStim.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir den Bau einer Kammer und eine Methode für die Behandlung von mesenchymalen Stammzellen mit EStim, der verbesserte osteogene Differenzierung führt.
Das EStim Setup präsentiert erfordert keine spezielle Ausrüstung/wissen und von Nachwuchswissenschaftlern in einem standard Stammzell-Biologie/Biochemie Labor durchgeführt werden kann. Allerdings muss beim Erstellen und verwenden der EStim-Kammer, in ein paar wichtige Schritte geachtet werden. Beim Umgang mit der Platin-Ele…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch eine AO Foundation Gründungshilfe (03 / 14 / S-H) und die Stiftung Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) mit Sitz in Frankfurt/Main, Deutschland unterstützt.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
Referenzen
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