בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להקמת תא התרבות תאים שנועדו לחשוף תאים לסוגים שונים של גירוי חשמלי, ושימוש בו בטיפול גזע mesenchymal כדי לשפר את הבידול osteogenic.
Abstract
תאי גזע mesenchymal/סטרומה (MSCs) נעשה שימוש נרחב כדי לקדם את עצם ריפוי ברקמות הנדסה גישות. גירוי חשמלי (EStim) הוכח להגדיל MSC בידול osteogenic במבחנה, לקדם את עצם ריפוי בהגדרות קליניים. כאן נתאר הקמת חדר תרבות תא EStim ואלשין השימוש בטיפול עצמות מח-נגזר MSC כדי לשפר את הבידול osteogenic. מצאנו כי בטיפול MSCs עם EStim במשך 7 ימים גורמת לעליה משמעותית הבידול osteogenic, חשוב, אפקט pro-osteogenic זה נמשכת זמן רב לאחר (7 ימים) EStim הוא הופסק. גישה זו של pretreating MSCs עם EStim כדי לשפר את הבידול osteogenic יכול לשמש כדי למטב את רקמת העצם הנדסה תוצאות הטיפול, לפיכך, לסייע להם לממש את הפוטנציאל הטיפולי מלאה שלהם. בנוסף יישום זה, הזה EStim תא תרבות קאמרית, פרוטוקול יכול לשמש גם כדי לחקור התנהגויות תא רגיש EStim אחרות, כגון העברה, התפשטות, אפופטוזיס מצורף לגרדום.
Introduction
עלייה טראומה ו/או פגמים הנוצרות על-ידי מחלת עצם מטופלים באמצעות צירופים שונים של טיפול בתאי וטכנולוגיות רפואה רגנרטיבית. MSCs הם התא לפי בחירה, טיפולים כאלה, בשל פעילות osteogenic יחסית גבוהה, בידוד, הרחבת והיעילות, בטיחות1. על מנת למקסם את הפעילות osteogenic שלהם, לכן, למטב את האפקטיביות הטיפולית שלהם, הוכנסו מספר שיטות לטיפול MSCs לפני השימוש בטיפולים אלה (כפי שנסקרו על ידי Mauney et al.2). שיטה אחת כזאת היא EStim, אשר הוכח לשפר MSC בידול osteogenic חוץ גופית3 ולקדם את עצם ריפוי ויוו4. למרות המספר הגדל והולך של לימודי התמקדות בטיפול MSCs עם EStim, משטר אופטימלית עבור למקסם את אפקט pro-osteogenic של EStim טרם מוגדר.
שיטות הפריה אחרות באמצעות EStim לנצל את גשרי מלח בתוך המדיום תרבות, המפריד בין תאים אלקטרודות מתכתי5. היתרון של זה היא כי אספקת EStim באמצעות גשרים מלח מבטלת המבוא של לוואי כימיות (למשל, קורוזיה של אלקטרודות מתכתי) שעשויים להיות ציטוטוקסיות. למרות יתרון זה, גשרי מלח הם מסורבלים כדי לעבוד עם, EStim הם מספקים שונה כי מודלים ויוו ונמסרו ב, ולכן קשה לתאם את התוצאות המתקבלות בעת שימוש את שתי המערכות. כיוונוני לספק EStim באמצעות אלקטרודות מתכתי או פחמן קבוע בתוך הבארות התרבות התא (כפי שנסקרו על ידי Hronik-Tupaj, קפלן6) כדאי לדמות התקנים המשמשים ויוו; עם זאת, התקנים אלה שקשה לנקות/לחטא בין שימושים, מספר התאים שניתן ללמוד לכל ניסוי מוגבל. תיכננו תא EStim המובאים כאן במיוחד כדי לטפל המגבלות של אלה כיוונונים אחרים. בעוד רוב הניסיון שלנו באמצעות לשכת EStim הזה כבר עם 2D ו 3D תרבויות המכיל מח עצם ושומן-רקמה-נגזר MSCs3,4, אחד היתרונות המרכזיים של החדר הזה זה תכליתי והוא, עם יחסית מינורי שינויים, ניתן להתאים ללמוד את סוגי תאים אחרים תחת מגוון תנאים שונים.
כאן נתאר את בניית חדר תרבות תא EStim; לאחר מכן, נדגים את השימוש בו על ידי MSCs בטיפול עם משטרי שונים של EStim ומדידת האפקט המתקבל על בידול osteogenic. בידול osteogenic MSC מוערך באמצעות התצהיר סידן פעילות פוספטאז אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic. חשוב, ב עבר ניסויים בשימוש תוכנית התקנה זו, הבחנו כי השפעות פרו-osteogenic אלו נמשכות זמן רב לאחר הטיפול EStim הופסק.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נתאר הקמת תא, שיטה לטיפול בבעיות גזע mesenchymal עם EStim כי התוצאות התמיינות משופרת osteogenic.
הגדרת EStim שהוצגו לא דורשת ציוד/ידע מיוחד, יכול להתבצע בתוך מעבדה ביולוגיה/ביוכימיה סטנדרטי בתאי גזע על ידי החוקרים הצעירים. עם זאת, כאשר בונים ומפעילים תא EStim, טיפול מיוחד חייב להילקח מספר ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה של אאו גרנט סטארט-אפ של קרן (S-14-03 H) ושל קרן Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) ב פרנקפורט, גרמניה.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
Referenzen
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?. Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k’o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
