건설 및 생체 외에서 중간 엽 줄기/Stromal 세포 Osteogenic 차별화를 강화 하기 위한 전기 자극 챔버의 사용
Summary
여기 우리는 다양 한 유형의 전기 자극 및 osteogenic 차별화를 향상 시키기 위해 중간 엽 줄기 세포를 치료에 사용 하는 셀을 표시 하도록 셀 문화 챔버의 건설에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
중간 엽 줄기/stromal 세포 (MSCs) 뼈 조직 공학 접근에에서 치유를 촉진 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 전기 자극 (EStim) MSC osteogenic 차별화 생체 외에서 증가 하 여 뼈 임상 설정에서 치유를 촉진 입증 되었습니다. 여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버의 건설을 설명 하 고 치료에 사용 쥐 뼈 골 수 유래 MSC osteogenic 차별화를 강화 하. 우리는 osteogenic 분화에 상당한 증가 결과 MSCs EStim와 7 일 동안 치료 하 고이 프로 osteogenic 효과 (7 일) EStim 단종 후에 오랫동안 지속 되는 중요 한 것은, 발견. 이 이렇게 pretreating EStim osteogenic 차별화를 강화 하기 위하여와 MSCs의 뼈 조직 공학 치료 결과 최적화 하 고, 따라서, 그들의 전체 치료 잠재력을 달성 하는 데 도움이 사용 될 수 있습니다. 이 응용 프로그램 뿐 아니라이 EStim 셀 문화 실과 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다 다른 EStim 민감한 셀 동작, 마이그레이션, 확산, apoptosis, 비 계 첨부 파일 등을 조사 하.
Introduction
외상 또는 질병 유발 뼈 결함 증가 세포 치료 및 재생 의학 기술의 다양 한 조합을 사용 하 여 치료를 받고 있다. MSCs 이러한 치료 그들의 상대적으로 높은 osteogenic 활동, 격리 및 확장, 효율과 안전1때문에 선택의 셀입니다. Osteogenic 그들의 활동을 극대화 하 고, 따라서 그들의 치료 효과 최적화, 여러 가지 방법은 조작 하 MSCs 이러한 치료에 그들의 사용에 앞서 (Mauney 외.2검토) 도입 되었습니다. 하나 이러한 방법은 EStim 시험관3 MSC osteogenic 차별화를 강화 하 고 뼈 vivo에서4치유 촉진을 보여줘 왔다. MSCs EStim와 치료에 집중 하는 연구의 증가도 불구 하 고 EStim의 프로 osteogenic 효과 극대화 하기 위한 최적의 처방 아직 정의할 수 있다.
EStim를 사용 하 여 다른 생체 외 방법 금속 전극5에서 세포를 분리 배양에 빠져들 소금 다리를 이용 한다. 이것의 장점은 EStim 소금 다리를 통해 제공 세포 독성 수 있습니다 화학 부산물 (예를 들면, 금속 전극의 부식)의 도입을 없앤다. 이 장점에도 불구 하 고 소금 교량 작업할 복잡 고 제공 EStim 어려운 두 시스템을 사용할 때 얻은 결과 연결 하 고 그 전달된에 vivo에서 모델에서 다릅니다. 셀 문화 우물 안에 고정 하는 금속 또는 탄소 전극을 통해 EStim 제공 하는 설정 (Hronik-Tupaj와 카 플 란6검토)으로 더 나은 시뮬레이션 한다 vivo;에 사용 되는 장치 그러나,이 소자 들은 어려운 사용 하는 사이 청소/소독 하 고 실험 당 공부 될 수 있다 셀 수는 제한 됩니다. 우리는 여기에 이러한 다른 설정의 한계를 해결 하기 위해 구체적으로 제시 EStim 챔버 설계. 반면이 EStim 챔버를 사용 하 여 우리의 경험의 대부분은 2d 되었습니다 이며 골 수 및 지방-조직-파생 MSCs3,4포함 된 3D 문화,이 챔버의 주요 장점은 그것 다목적 이며, 상대적으로 사소한 변경, 다양 한 다른 조건에서 다른 세포 유형 공부를 적용할 수 있습니다.
여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버;의 건설을 설명 다음, 우리 EStim osteogenic 차별화에 효과 측정의 다른 식이요법으로 치료 MSCs에서 그것의 사용을 보여 줍니다. MSC osteogenic 차별화 칼슘 증 착, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동, 및 osteogenic 마커 유전자 발현을 통해 평가 됩니다. 중요 한 것은,에이 설치를 사용 하는 실험 과거 관찰 이러한 프로 osteogenic 효과 EStim 치료 중단 후에 오랫동안 지속 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리는 챔버와 향상 된 osteogenic 차별화 결과 EStim와 중간 엽 줄기 세포를 치료 하는 방법의 건설을 설명 합니다.
제시 EStim 설치 특수 장비/지식이 필요로 하지 않습니다 하 고 주니어 연구자에 의해 표준 줄기 세포 생물학/생화학 실험실에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 건물 EStim 챔버를 사용 하는 경우에, 몇 가지 중요 한 단계에서 특별 한 배려를가지고 한다. 백 금 전극…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 AO 기초 시작 그랜트 (S-14-03 H) 및 프랑크푸르트, 독일에에서 본사를 둔 Friedrichsheim 재단 (재단 Friedrichsheim) 부분에서 지원 되었다.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
Referenzen
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