建設と質間葉系幹細胞の骨分化を強化するため電気刺激室の使用
Summary
ここで各種電気刺激や間葉系幹細胞の骨分化誘導を強化への治療に使用するセルを公開するために設計された細胞培養室の建設のためのプロトコルを提案する.
Abstract
間葉系幹/間質細胞 (MSCs) は、骨の組織工学的アプローチで治癒を促進するために広く使用されています。電気刺激 (EStim) は、MSC 骨分化誘導体外を高め、臨床現場で治癒を促進するために実証されています。ここで EStim 細胞培養室の構造を説明し、治療での使用ラット骨骨髄由来 MSC 骨分化誘導を強化します。分かった骨分化誘導の大幅な増加の結果 7 日間 EStim で MSCs を扱う重要なは、このプロ骨形成促進の効果続く (7 日) EStim は中止後に長い。骨の治療成果を工学を最適化し、したがって、彼らの完全治療の可能性を達成するためにそれらを助ける骨分化誘導を強化する EStim で MSCs を前処理のこのアプローチをされる可能性があります。このアプリケーションでは、に加えてこの EStim 細胞培養室とプロトコルも使用できます移行、増殖、アポトーシス、足場添付ファイルなど他 EStim 敏感な細胞の挙動を調査するため。
Introduction
外傷や疾患による骨欠損の増加は、細胞治療や再生医療技術のさまざまな組み合わせを使用して扱われています。MSCs は、その比較的高い貪食、分離と拡張の効率と安全性1のため、そのような処置の選択のセルです。骨形成促進活動を最大化し、彼らの治療の有効性を最適化するため、(Mauney ら2がレビュー済み) として、これらの治療法での使用前に MSCs を操作するいくつかの方法を紹介されています。このような方法の 1 つは EStim MSC による骨分化培養3を強化し、生体内で4を治癒を促進するために示されています。EStim の MSCs の治療に着目した研究の数の増加、にもかかわらず EStim のプロ骨形成促進効果を最大化するための最適な療法を定義するが。
他体外法 EStim 利用塩橋金属電極5から細胞を分離培養液に浸漬します。この方法の利点は、塩橋を通じて EStim を提供する可能性があります細胞傷害性化学の副産物 (例えば、金属電極の腐食) の導入でなくなることです。この利点にもかかわらず塩橋は操作が、面倒と提供する EStim 異なる配信で生体内でモデル化、2 つのシステムを使用して得られた結果を関連付けることが困難します。細胞文化井戸内固定金属または炭素電極を介して EStim を提供のセットアップ (Hronik Tupaj とカプランの6によって再検討されました) よりシミュレート vivo; で使用されるデバイスただし、これらのデバイスが使用するクリーン/殺菌しにくい、実験ごとに学ぶことができるセルの数は限られています。これらの他の設定の制限を解決するためにここに提示 EStim チャンバーを考案しました。この EStim チャンバーを用いた経験のほとんど 2 D とされているが、骨髄や脂肪-組織由来 MSCs3,4を含む 3 D 文化、この商工会議所の主な利点は、それは汎用性で比較的マイナーな変更は、様々 な条件の下で他の細胞型を勉強する合わせることができます。
ここで EStim 細胞培養室の構造を説明します。その後、EStim と測定結果に及ぼす骨分化誘導の異なるレジメンで治療 MSCs によってその使用を示します。MSC による骨分化は、カルシウム沈着、アルカリホスファターゼ活性および骨マーカー遺伝子発現を介して評価されます。重要なは、過去のこのセットアップを使用する実験が見られました EStim 治療を中止した後にこれらのプロ骨形成促進効果が存続すること。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでチャンバー、強化された骨分化誘導の結果 EStim による間葉系幹細胞を治療のための方法の構築について述べる.
提示 EStim セットアップ専門機器を必要としないし、若手研究者による標準的な幹細胞生物学・生化学研究室で実行できます。ただし、建物、EStim チャンバーを使って、特別な注意が必要、いくつかの重要なステップに。白金電極を処理するとき余分な?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、AO 財団創業助成金 (S-14-03 H)、ブランクフルトか本管、ドイツに拠点を置く Friedrichsheim 財団 (財団 Friedrichsheim) によって部分的に支えられました。
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
Referenzen
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