استخدام الاشعه تحت الحمراء القريبة والمسح عاليه الدقة لقياس تعبير البروتين في الدماغ القوارض
Summary
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول يستخدم الاصباغ الاشعه تحت الحمراء القريبة بالاقتران مع المسح الضوئي مناعي وعاليه الدقة لفحص البروتينات في مناطق الدماغ.
Abstract
العلوم العصبية هي دراسة كيفيه توسط الخلايا في الدماغ وظائف مختلفه. قياس تعبير البروتين في الخلايا العصبية والخلايا الدبقيه أمر بالغ الاهميه لدراسة علوم الأعصاب كما يتم تحديد وظيفة الخلوية من قبل تكوين ونشاط البروتينات الخلوية. في هذه المقالة ، ونحن وصف كيف يمكن الجمع بين المناعية الكيمياء مع الاشعه تحت الحمراء القريبة من المسح الضوئي عاليه الدقة لتوفير قياس شبه كمي من التعبير البروتين في مناطق الدماغ متميزة. ويمكن استخدام هذه التقنية للتعبير البروتين واحد أو مزدوج في نفس المنطقة الدماغ. يمكن استخدام قياس البروتينات بهذه الطريقة للحصول علي تغيير نسبي في تعبير البروتين مع التلاعب التجريبي ، والتوقيع الجزيئي للتعلم والذاكرة ، والنشاط في المسارات الجزيئية ، والنشاط العصبي في مناطق الدماغ المتعددة. باستخدام البروتينات الصحيحة والتحليل الإحصائي ، يمكن تحديد الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ أيضا. ونظرا لسهوله تنفيذ الكيمياء المناعية في المختبر ، فان استخدام المناعة المناعية مع المسح الضوئي العالي الدقة بالاشعه تحت الحمراء يمكن ان يوسع من قدره الأعصاب علي فحص العمليات البيولوجية العصبية علي مستوي الانظمه.
Introduction
الدراسة من العلوم العصبية تتعلق بالتحقيق في كيفيه الخلايا في الدماغ توسط وظائف محدده1. هذه يمكن ان تكون الخلوية في الطبيعة مثل كيفيه الخلايا التي تمنح الحصانة في الجهاز العصبي المركزي أو يمكن ان تنطوي علي التجارب التي تهدف إلى شرح كيفيه نشاط الخلايا العصبية في الحصين الظهري يؤدي إلى الملاحة المكانية. بمعني واسع ، يتم تحديد وظيفة الخلوية من قبل البروتينات التي يتم التعبير عنها في خليه ونشاط هذه البروتينات2. ونتيجة لذلك ، فان قياس التعبير و/أو نشاط البروتينات في خلايا المخ أمر بالغ الاهميه لدراسة العلوم العصبية.
وهناك عدد من التقنيات المتاحة لقياس التعبير البروتين في الدماغ. وتشمل هذه الأساليب في الكائنات المجرية مثل التضاريس الانبعاثات بوزيترون لكثافة مستقبلات3 والصغرى-غسيل الكلي للببتيدات الصغيرة4. أكثر شيوعا ، وتستخدم أساليب الجسم الآخر لفحص وظيفة البروتين والتعبير. وتشمل هذه التقنيات الطيف الكتلي5، وصمه عار الغربية والانزيم المرتبطة المقايسة المناعية (اليسا)6، والمناعية الكيمياء7. ويستخدم علي نطاق واسع في مجال الكيمياء العصبية المناعية. وينطوي هذا الأسلوب علي استخدام الأجسام المضادة الاساسيه للكشف عن البروتين (أو مستضد) الفائدة (مثلا ، c-Fos) والأجسام المضادة الثانوية المترافقة للكشف عن مجمع الأجسام المضادة للبروتين الأساسي (الشكل 1). لتمكين الكشف عن الأجسام المضادة البروتين-الاساسيه-مجمع الأجسام المضادة الثانوية ، والأجسام المضادة الثانوية لديها عوامل مؤكسده مثل البيروكسيداز الفجل (التي) مترافق لهم. وهذا يسمح لتشكيل الرواسب في الخلايا التي يمكن الكشف عنها باستخدام المجهر الضوئي7. الأجسام المضادة الثانوية يمكن أيضا ان يكون المواد الكيميائية يتالق مترافق لهم (اي الفلوروبيورس). عندما تحفز هذه المواد الكيميائية تنبعث منها الضوء ، والتي يمكن استخدامها للكشف عن البروتين-المضادات الاساسيه-مجمعات الأجسام المضادة الثانوية7. وأخيرا ، في بعض الأحيان الأجسام المضادة الاوليه لديها عوامل الحد والمواد الكيميائية مضان الملحقة بها السلبية مباشره الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية7 (الشكل 1).
ومن المثير للاهتمام ، العديد من الأساليب المناعية تسمح لتصور البروتينات في خلايا المخ ، ولكن ليس القدرة علي قياس كميه البروتين في خليه معينه أو منطقه الدماغ. استخدام المجهر الضوئي للكشف عن الرواسب من ردود الفعل الحد يسمح لتصور الخلايا العصبية والخلايا الأخرى ، ولكن هذا الأسلوب لا يمكن استخدامها لقياس التعبير البروتين في الزنزانات أو في منطقه الدماغ محدده. من الناحية النظرية ، يمكن استخدام المجهر الفلوري لهذا ، لان الضوء المنبعث من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية هو مقياس للأجسام المضادة للبروتين الاوليه-مجمع الأجسام المضادة الثانوية. ومع ذلك ، فان الفلورية في انسجه المخ يمكن ان تجعل من الصعب استخدام المجهر الفلوري لقياس التعبير البروتين في انسجه المخ8. ونتيجة لذلك ، نادرا ما يستخدم الضوء المنبعث من الصور الفلورية لأنسجه المخ لقياس تعبير البروتين في الدماغ.
يمكن معالجه العديد من هذه القضايا باستخدام الاشعه تحت الحمراء شبه الكيميائية بالتزامن مع المسح الضوئي عاليه الدقة9,10. في هذه المقالة ، ونحن وصف كيف المناعية الكيميائية إلى جانب فلوبهورس في أطياف الانبعاثات شبه الاشعه تحت الحمراء يمكن الجمع بين المسح الضوئي عاليه الدقة (علي سبيل المثال ، 10-21 μm) للحصول علي الصور الحاده التي تسمح للقياس الكمي نصف البروتين في متميزة مناطق الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
تظهر النتائج المعروضة في هذه المقالة انه يمكن استخدام الخلايا المناعية القريبة من الاشعه تحت الحمراء في تركيبه مع المسح الضوئي عالي الدقة للحصول علي مقاييس شبه كميه لتعبير البروتين في انسجه المخ. ويمكن أيضا ان تستخدم لتسميه اثنين من البروتينات في وقت واحد في نفس المنطقة الدماغ. وقد استخد?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل البحث في هذا التقرير من قبل منحه الهدف من NIGMS (1P20GM103653) منح إلى DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
Referenzen
- Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
