Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que utiliza colorantes de infrarrojo cercano junto con inmunohistoquímica y escaneo de alta resolución para analizar las proteínas en las regiones cerebrales.
Abstract
La neurociencia es el estudio de cómo las células en el cerebro median diversas funciones. La medición de la expresión proteica en las neuronas y la glia es fundamental para el estudio de la neurociencia, ya que la función celular está determinada por la composición y la actividad de las proteínas celulares. En este artículo, describimos cómo la inmunocitoquímica se puede combinar con el escaneo de alta resolución de infrarrojo cercano para proporcionar una medida semi-cuantitativa de la expresión proteica en regiones cerebrales distintas. Esta técnica se puede utilizar para expresión de proteína simple o doble en la misma región del cerebro. La medición de proteínas de esta manera se puede utilizar para obtener un cambio relativo en la expresión de proteínas con una manipulación experimental, la firma molecular del aprendizaje y la memoria, la actividad en vías moleculares y la actividad neuronal en múltiples regiones cerebrales. Utilizando las proteínas correctas y el análisis estadístico, la conectividad funcional entre las regiones cerebrales también se puede determinar. Dada la facilidad de implementación de la inmunocitoquímica en un laboratorio, el uso de inmunocitoquímica con escaneo de alta resolución de infrarrojo cercano puede expandir la capacidad del neurocientífico para examinar los procesos neurobiológicos a nivel de sistemas.
Introduction
El estudio de la neurociencia se refiere a una investigación de cómo las células en el cerebro median funciones específicas1. Estos pueden ser de naturaleza celular como cómo las células de la glia confieren inmunidad en el sistema nervioso central o pueden implicar experimentos que tienen como objetivo explicar cómo la actividad de las neuronas en el hipocampo dorsal conduce a la navegación espacial. En un sentido amplio, la función celular está determinada por las proteínas que se expresan en una célula y la actividad de estas proteínas2. Como resultado, medir la expresión y/o actividad de las proteínas en las células cerebrales es fundamental para el estudio de la neurociencia.
Hay una serie de técnicas disponibles para medir la expresión de proteínas en el cerebro. Estos incluyen métodos in vivo como la topografía de emisión de positrones para densidades de receptores3 y micro-diálisis para péptidos pequeños4. Más comúnmente, los métodos ex vivo se utilizan para examinar la función y expresión de las proteínas. Estos incluyen las técnicas de espectrometría de masas5, Western Blot y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)6e inmunocitoquímica7. La inmunocitoquímica es ampliamente utilizada en el campo de la neurociencia. Esta técnica implica el uso de un anticuerpo primario para detectar una proteína (o antígeno) de interés (p. ej., c-Fos) y un anticuerpo secundario conjugada para detectar el complejo proteico-primario de anticuerpos (figura 1). Para permitir la detección del complejo de anticuerpos secundario-anticuerpo primario-proteico, los anticuerpo secundarios tienen agentes oxidantes como la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugados con ellos. Esto permite la formación de precipitados en las células que se pueden detectar mediante microscopía ligera7. Los anticuerpos secundarios también pueden tener compuestos químicos fluorescencia conjugados a ellos (es decir, fluoróforos). Cuando se estimulan estos productos químicos emiten luz, que se puede utilizar para detectar proteína-anticuerpo primario-complejos de anticuerpos secundarios7. Por último, a veces los anticuerpos primarios tienen agentes reductores y sustancias químicas de fluorescencia que se unen a ellos negando directamente la necesidad de anticuerpos secundarios7 (figura 1).
Curiosamente, muchos métodos de inmunocitoquímica permiten la visualización de proteínas en las células cerebrales, pero no la capacidad de cuantificar la cantidad de proteína en una región específica de la célula o el cerebro. El uso de microscopía de luz para detectar precipitados de las reacciones de reducción permite la visualización de las neuronas y la glia, pero este método no se puede utilizar para cuantificar la expresión proteica en las células o en una región cerebral específica. En teoría, la microscopía de fluorescencia se puede utilizar para esto, porque la luz emitida por el anticuerpo secundario fluorescente es una medida del complejo de anticuerpos secundario-anticuerpo primario-proteico. Sin embargo, la autofluorescencia en el tejido cerebral puede dificultar el uso de la microscopía de fluorescencia para cuantificar la expresión proteica en el tejido cerebral8. Como resultado, la luz emitida por imágenes fluorescentes de tejido cerebral raramente se utiliza para cuantificar la expresión proteica en el cerebro.
Muchos de estos problemas se pueden abordar utilizando inmunocitoquímica de infrarrojo cercano junto con el escaneo de alta resolución9,10. En este artículo, describimos cómo la inmunocitoquímica junto con los fluoróforos en los espectros de emisión de infrarrojo cercano se pueden combinar con el escaneo de alta resolución (por ejemplo, 10 – 21 μm) para obtener imágenes nítidas que permiten la semicuantificación de proteínas en distintas regiones cerebrales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los resultados presentados en este artículo muestran que la inmunocitoquímica del infrarrojo cercano en combinación con la exploración de alta resolución se puede utilizar para obtener medidas semicuantitativas de la expresión de la proteína en el tejido cerebral. También se puede utilizar para etiquetar dos proteínas simultáneamente en la misma región del cerebro. Hemos utilizado previamente inmunohistoquímica de infrarrojo cercano para medir la expresión génica temprana inmediata en múltiples regiones ce…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en este informe fue financiada por una subvención de Target de los NIGMS (1P20GM103653) otorgada a DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
Referenzen
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