Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.
Abstract
A neurociência é o estudo de como as células do cérebro mediam várias funções. A expressão da proteína de medição nos neurônios e na glia é fundamental para o estudo da neurociência, pois a função celular é determinada pela composição e atividade das proteínas celulares. Neste artigo, nós descrevemos como Immunocytochemistry pode ser combinado com a exploração de alta resolução infravermelho próximo para fornecer uma medida semiquantitativa da expressão da proteína em regiões distintas do cérebro. Esta técnica pode ser usada para a única ou expressão dobro da proteína na mesma região do cérebro. A medição de proteínas desta forma pode ser usada para obter uma mudança relativa na expressão protéica com uma manipulação experimental, assinatura molecular de aprendizado e memória, atividade em vias moleculares e atividade neural em várias regiões cerebrais. Usando as proteínas corretas e a análise estatística, a conectividade funcional entre as regiões cerebrais também pode ser determinada. Dada a facilidade de implementação de imunocitoquímica em um laboratório, usando Immunocytochemistry com varredura de alta resolução infravermelho próximo pode expandir a capacidade do neurocientista para examinar os processos neurobiológicos em um nível de sistemas.
Introduction
O estudo da neurociência diz respeito a uma investigação de como as células do cérebro mediam funções específicas1. Estes podem ser de natureza celular, como a forma como as células glia conferem imunidade no sistema nervoso central ou podem envolver experimentos que visam explicar como a atividade dos neurônios no hipocampo dorsal leva à navegação espacial. Em um sentido amplo, a função celular é determinada pelas proteínas que são expressas em uma célula e a atividade dessas proteínas2. Como resultado, medir a expressão e/ou atividade de proteínas nas células cerebrais são críticas para o estudo da neurociência.
Um número de técnicas estão disponíveis para medir a expressão da proteína no cérebro. Estes incluem métodos in vivo, como topografia de emissão de pósitrons para densidades de receptores3 e microdiálise para pequenos peptídeos4. Mais comumente, os métodos ex vivo são usados para examinar a função e a expressão protéica. Estes incluem técnicas de espectrometria de massas5, Western blot e ensaio imunoenzimático (ELISA)6, e Immunocytochemistry7. Immunocytochemistry é amplamente utilizado no campo da neurociência. Esta técnica envolve o uso de um anticorpo preliminar para detectar uma proteína (ou o antígeno) do interesse (por exemplo, c-fos) e um anticorpo secundário conjugado para detectar o complexo proteína-preliminar do anticorpo (Figura 1). Para permitir a deteção do complexo anticorpo-secundário da proteína-preliminar do Antibody, os anticorpos secundários têm agentes oxidantes tais como o peroxidase do rábano (HRP) conjugados a eles. Isso permite a formação de precipitados em células que podem ser detectadas por meio de microscopia de luz7. Os anticorpos secundários podem igualmente ter fluorescência dos produtos químicos conjugados a eles (isto é, Fluorophores). Quando estimulados estes produtos químicos emitem a luz, que pode ser usada para detectar complexos anticorpo-secundários proteína-primários do anticorpo7. Por fim, os anticorpos primários, por vezes, têm agentes redutores e produtos químicos de fluorescência anexados a eles, negando diretamente a necessidade de anticorpos secundários7 (Figura 1).
Curiosamente, muitos métodos Immunocytochemistry permitem a visualização de proteínas em células cerebrais, mas não a capacidade de quantificar a quantidade de proteína em uma determinada região da célula ou do cérebro. Usar a microscopia de luz para detectar precipitados das reações da redução permite o visualização dos neurônios e do glia, mas este método não pode ser usado para quantificar a expressão da proteína nas pilhas ou em uma região específica do cérebro. Na teoria, a microscopia de fluorescência pode ser usada para esta, porque a luz emitida do anticorpo secundário fluorescente é uma medida do complexo anticorpo-secundário proteína-preliminar do anticorpo. No entanto, a autofluorescência no tecido cerebral pode dificultar a utilização da microscopia de fluorescência para quantificar a expressão protéica no tecido cerebral8. Em conseqüência, a luz emitida das imagens fluorescentes do tecido de cérebro é usada raramente para quantificar a expressão da proteína no cérebro.
Muitas destas edições podem ser endereçadas usando Immunocytochemistry near-infrared conjuntamente com a exploração de alta resolução9,10. Neste artigo, nós descrevemos como o Immunocytochemistry acoplado com os fluoróforos nos espectros de emissão do próximo-infravermelho pode ser combinado com a exploração de alta resolução (por exemplo, 10 – 21 μm) para obter as imagens afiadas que permitem a semiquantificação da proteína em distinto regiões cerebrais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os resultados apresentados neste artigo mostram que o Immunocytochemistry próximo-infravermelho em combinação com a exploração de alta resolução pode ser usado para obter medidas Semiquantitativas da expressão da proteína no tecido de cérebro. Ele também pode ser usado para rotular duas proteínas simultaneamente na mesma região do cérebro. Nós usamos previamente immunohistochemistry próximo-infravermelho para medir a expressão adiantada imediata do gene em regiões múltiplas do cérebro<sup class="xref"…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa neste relatório foi financiada por uma subvenção-alvo dos NIGMS (1P20GM103653) concedido à DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
Referenzen
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