שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.
Abstract
מדעי המוח הוא חקר כיצד תאים במוח בתווך פונקציות שונות. מדידת חלבון הביטוי בנוירונים ו glia היא קריטית לחקר מדעי המוח כפונקציה תאית נקבעת על ידי הרכב ופעילות של חלבונים סלולריים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד ניתן לשלב את היכולות האימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום כדי לספק מידה חצי כמותית של ביטוי חלבון באזורי מוח נפרדים. ניתן להשתמש בטכניקה זו לביטוי חלבון יחיד או כפול באותו אזור המוח. מדידת חלבונים בצורה זו יכולה לשמש כדי לקבל שינוי יחסי בביטוי חלבון עם מניפולציה ניסיוני, חתימה מולקולרית של למידה וזיכרון, פעילות במסלולים מולקולריים, ופעילות עצבית באזורי מוח מרובים. ניתן לקבוע באמצעות החלבונים והניתוחים הסטטיסטיים הנכונים, קישוריות פונקציונלית בין אזורי מוח. בהתחשב בקלות של יישום כימיה חיסונית במעבדה, שימוש באמצעות אימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום יכול להרחיב את יכולת הנוירומדען לבחון תהליכים נוירויולוגיים ברמת מערכות.
Introduction
המחקר של מדעי המוח חששות חקירה של איך תאים במוח מתווך פונקציות ספציפיות1. אלה יכולים להיות סלולריים בטבע כגון איך התאים גליה מעניקה חסינות במערכת העצבים המרכזית או יכול לכלול ניסויים שמטרתם להסביר כיצד הפעילות של נוירונים בהיפוקמפוס החלק המוביל לניווט מרחבי. במובן רחב, הפונקציה התאית נקבעת על ידי החלבונים המתבטאת בתא ואת הפעילות של חלבונים אלה2. כתוצאה מכך, מדידת הביטוי ו/או הפעילות של חלבונים בתאי המוח הם קריטיים לחקר מדעי המוח.
מספר טכניקות זמינות כדי למדוד ביטוי חלבון במוח. אלה כוללים בשיטות vivo כגון טופוגרפיה פליטת פוזיטרונים עבור צפיפויות הקולטן3 ו מיקרו-דיאליזה עבור פפטידים קטנים4. בדרך כלל, שיטות vivo ex משמשות כדי לבחון את תפקוד החלבון ואת הביטוי. אלה כוללים טכניקות ספקטרומטר המסה5, כתם מערבי ושיטת חיסוני מקושרת באמצעות אנזימים (אליסה)6, ואימונוציטוטוכימיה7. אימונוציטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המדעי המוח. טכניקה זו כוללת את השימוש בנוגדן העיקרי כדי לזהות חלבון (או אנטיגן) של עניין (g., c-Fos) ו נוגדן משני מצותת כדי לזהות את החלבון-העיקרי נוגדן קומפלקס (איור 1). כדי לאפשר זיהוי של החלבון-העיקרי נוגדן מורכב נוגדן, נוגדנים משניים יש סוכנים אוקסיגון כגון חזרת peroxidase (HRP) מעלה באוב להם. הדבר מאפשר היווצרות מאיצים בתאים שניתן לאתרם באמצעות מיקרוסקופ אור7. נוגדנים משניים יכולים להיות גם כימיקלים זרוח עלה באוב אותם (כלומר, fluorophores). כאשר מגורה אלה כימיקלים פולטים אור, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות חלבון-ראשי נוגדן משני מכלולי נוגדנים7. לבסוף, לפעמים נוגדנים ראשוניים יש הפחתת סוכנים וכימיקלים פלואורסצנטית המצורפת אליהם ישירות לאשר את הצורך נוגדנים משניים7 (איור 1).
מעניין, הרבה שיטות אימונוציטוטוקכימיה לאפשר ויזואליזציה של חלבונים בתאי המוח, אבל לא את היכולת לכמת את כמות החלבון בתא מסוים או באזור המוח. שימוש במיקרוסקופיה קלה לאיתור מאיצים מתגובות הפחתת מאפשר ויזואליזציה של נוירונים ו גליה, אבל שיטה זו אינה יכולה לשמש לכמת ביטוי חלבון בתאים או באזור המוח מסוים. בתאוריה, מיקרוסקופ ניאון ניתן להשתמש בשביל זה, כי האור הנפלט הנוגדן משני פלורסנט הוא מדד של החלבון-העיקרי נוגדנים משני נוגדנים מורכבים. עם זאת, פלואורסצנטית אוטומטי ברקמת המוח יכול להקשות על השימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לכמת את הביטוי חלבון רקמת המוח8. כתוצאה מכך, אור הנפלט מתמונות פלורסנט של רקמת המוח משמש לעתים רחוקות כדי לכמת את הביטוי חלבון במוח.
רבים מהנושאים הללו ניתן לטפל באמצעות באמצעות אינפרא-אדום האימונוציטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה9,10. במאמר זה, אנו מתארים כיצד משולבים כימיה חיסונית עם fluorophores בספקטרום הפליטה הקרוב-אינפרא אדום ניתן לשלב עם סריקה ברזולוציה גבוהה (g., 10 – 21 μm) כדי לקבל תמונות חדות המאפשרות כימות החלבון בנפרד אזורי המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
התוצאות שהוצגו במאמר זה מראים כי קרוב-אינפרא-אדום אימונוציטוטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה ניתן להשתמש כדי לקבל אמצעים חצי כמותיים של ביטוי חלבון ברקמת המוח. זה יכול לשמש גם כדי לתייג שני חלבונים בו זמנית באותו אזור המוח. בעבר השתמשנו בשימוש קרוב-אינפרא אדום אימונוהיסטוכימיה כד?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר בדו ח זה מומן על ידי מענק היעד של הכושים (1P20GM103653) הוענק DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
Referenzen
- Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
