ショウジョウバエメラノガスターにおける血液脳関門完全性に関するアッセイ
Summary
血液脳関門の完全性は、神経系の機能のために重要です。ショウジョウバエメラノガスターでは、血液脳関門は後期胚形成時にグリア細胞によって形成される。このプロトコルは、D.メラノガスター胚および第3の恒星幼虫における血液脳関門形成および維持に関するアッセイ方法について説明する。
Abstract
適切な神経系の発達は、血液脳関門の形成、神経系へのアクセスを厳密に調節し、毒素や病原体から神経組織を保護する拡散障壁を含む。この障壁の形成の欠陥は神経障害と相関しており、この障壁の内訳は多くの神経変性疾患で観察されている。したがって、潜在的な治療標的を同定するためには、血液脳関門の形成と維持を調節する遺伝子を同定することが重要である。これらの遺伝子が神経発達において果たす正確な役割を理解するためには、改変された遺伝子発現が血液脳関門の完全性に及ぼす影響をアッセイする必要がある。血液脳関門の確立に機能する分子の多くは、フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターを含む真核生物種全体で保存されていることが判明している。フルーツハエは、神経系の発達と機能を調節する分子機構を調べる優れたモデルシステムであることが証明されています。このプロトコルは、D.メラノガスター発達の胚および幼虫期における血液脳関門の完全性をアッセイするための段階的な手順を説明する。
Introduction
発達中、細胞間のコミュニケーションと相互作用は、組織および臓器の構造と機能の確立に重要である。いくつかのケースでは、これらの細胞と細胞の相互作用は、適切な臓器機能を確保するために、周囲の環境から臓器を遮断します。これは、血液脳関門(BBB)によって絶縁される神経系の場合です。ヒトにおけるBBBの機能不全はてんかんを含む神経疾患と関連しており、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患においてバリアの破壊が観察されている1。哺乳動物において、BBBは内皮細胞2、3との間の緊密な接合によって形成される。フルーツフライを含む他の動物、ショウジョウバエメラノガスターは、グリア細胞からなるBBBを持っています。これらのグリア細胞は、神経系4に出入りする栄養素、廃棄物、毒素、および大きな分子の移動を制御するための選択的に透過性の障壁を形成する。これにより、アクションポテンシャルを発射するために必要な電気化学勾配の維持が可能になり、モビリティとコーディネーション4が可能になります。D. メラノガスターでは、グリアはカリウムが豊富な血液のような血球体5から神経系を保護する。
D.メラノガスターの中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)において、2つの外グリア層、下グリアおよび陰グリア、ならびに細胞外マトリックスの外ネットワーク、神経ラメラ、を形成する。ヘモリンパ脳およびヘモリンパ神経関門6は、この記事全体を通してBBBと呼ばれる。発達中に陰皮グリアはポリプロイドになり、神経系を囲むように拡大する 5,6,7,8,9, 10,11.皮下グリアは、血友リンパと神経系5、6、12との間の主な拡散障壁を提供する分離接合部を形成する。これらの接合部は、脊椎動物の骨髄グリアのパラノードで見つかった閉体状接合部と分子的に類似しており、哺乳類13、14のBBBにおけるタイトジャンクションと同じ機能を果たします。15歳,16歳,17.陰腸グリア分裂、成長、および代謝産物および大分子の拡散を調節するために、皮下グリアの周りに包む6,10,18,19.BBB形成は、25 °C 5、8で卵を産んだ後 (AEL)18.5h で完了します。これまでの研究では、BBB形成20、21、22の重要な調節因子である遺伝子を同定した。これらの遺伝子の正確な役割をよりよく理解するためには、これらの潜在的な調節因子の変異がBBBの完全性に及ぼす影響を調べることが重要である。これまでの研究では、胚および幼虫におけるBBBの完全性をアッセイするアプローチを概説してきたが、このアッセイのための包括的なプロトコルは、まだ5、7を説明していない。このステップバイステッププロトコルは、D.メラノガスター胚および第3のスター幼虫期におけるBBB整合性をアッセイする方法について説明する。
Protocol
1. サンプルの収集 胚コレクション 各胚コレクションケージでは、コレクションに20-25オスの最低50人の処女女性を使用します。これらのハエをコーンミール寒天食品(材料の表)でボトルに入れ、コレクション23を始める前に1−2日間インキュベートする。注:より多くのハエを使用することができますが、女性と男性の比?…
Representative Results
ここで説明する方法は、D.メラノガスター胚および幼虫におけるCNS全体のBBBの完全性の可視化を可能にする(図1)。後期胚発生におけるBBB形成の完了時に、BBBは脳およびVNC5から大きな分子を除外する機能を有する。このプロトコルは、この関数を利用してBBB形成をアッセイする。野生型(オレゴンR)後期17(20−21h齢)胚をスルフォルホダミン101酸塩化?…
Discussion
このプロトコルは、D.メラノガスター発達の後期胚および第3の星幼虫期におけるBBB完全性のアッセイに必要なステップの包括的な説明を提供する。同様のアプローチは、開発中のBBBの完全性をアッセイするために他の場所で説明されているだけでなく、成人段階5、7、29、30.しかし、材料や…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、注射用機器の使用に関して、F.ブライアン・ピケット博士とロドニー・デール博士に感謝しています。この研究は、ロヨラ大学シカゴからM.D.、D.T.、およびJ.J.への研究資金によって資金提供されました。
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
Referenzen
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin–novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- . BDSC Cornmeal Food Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017)
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetik. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Entwicklungsbiologie. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
Diesen Artikel zitieren
Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233, doi:10.3791/60233 (2019).