Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster
Summary
La integridad de la barrera hematoencefálica es fundamental para la función del sistema nervioso. En Drosophila melanogaster, la barrera hematoencefálica se forma por células gliales durante la embriogénesis tardía. Este protocolo describe los métodos para el ensayo para la formación y el mantenimiento de barreras hematoencefálicas en embriones D. melanogaster y larvas de tercera estrella.
Abstract
El desarrollo adecuado del sistema nervioso incluye la formación de la barrera hematoencefálica, la barrera de difusión que regula estrechamente el acceso al sistema nervioso y protege el tejido neural de toxinas y patógenos. Los defectos en la formación de esta barrera se han correlacionado con las neuropatías, y la descomposición de esta barrera se ha observado en muchas enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es fundamental identificar los genes que regulan la formación y el mantenimiento de la barrera hematoencefálica para identificar posibles dianas terapéuticas. Con el fin de entender las funciones exactas que estos genes juegan en el desarrollo neuronal, es necesario determinar los efectos de la expresión génica alterada en la integridad de la barrera hematoencefálica. Muchas de las moléculas que funcionan en el establecimiento de la barrera hematoencefálica se han encontrado para ser conservadas a través de especies eucariotas, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Las moscas de la fruta han demostrado ser un excelente sistema modelo para examinar los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo y la función del sistema nervioso. Este protocolo describe un procedimiento paso a paso para el ensayo de la integridad de la barrera hematoencefálica durante las etapas embrionarias y larvales del desarrollo de D. melanogaster.
Introduction
Durante el desarrollo, la comunicación celular y las interacciones son fundamentales para el establecimiento de la estructura y función de tejidos y órganos. En algunos casos, estas interacciones células-células sellan los órganos del entorno circundante para asegurar el funcionamiento adecuado del órgano. Este es el caso del sistema nervioso, que está aislado por la barrera hematoencefálica (BBB). Disfunción del BBB en seres humanos se ha relacionado con trastornos neurológicos incluyendo epilepsia, y la descomposición de la barrera se ha observado en enfermedades neurodegenerativas incluyendo esclerosis múltiple y esclerosis lateral amiotrófica1. En los mamíferos, el BBB está formado por uniones estrechas entre las células endoteliales2,3. Otros animales, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, tienen un BBB compuesto de células gliales. Estas células gliales forman una barrera selectivamente permeable para controlar el movimiento de nutrientes, productos de desecho, toxinas y moléculas grandes dentro y fuera del sistema nervioso4. Esto permite el mantenimiento del gradiente electroquímico necesario para disparar potenciales de acción, permitiendo la movilidad y coordinación4. En D. melanogaster, la glia protege el sistema nervioso de la hemolinfa5rica en potasio.
En el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (PNS) de D. melanogaster, dos capas glias externas, la glia subperineurial y la glia perineurial, así como una red externa de matriz extracelular, la lamela neural, forman la hemolinfa-cerebro y la barrera del nervio hemafifáfico6, conocido como el BBB a lo largo de este artículo. Durante el desarrollo la glia subperineurial se convierte nofoides y se agranda para rodear el sistema nervioso5,6,7,8,9,10,11 . La glia subperineurial forma uniones septato, que proporcionan la principal barrera de difusión entre la hemolinfa y el sistema nervioso5,6,12. Estas uniones son molecularmente similares a las uniones similares a septatos que se encuentran en los paranodos de la glia mielinante en vertebrados, y realizan la misma función que las uniones estrechas en el BBB de los mamíferos13,14, 15 , 16 , 17. La glia perineurial divide, crece y envuelve alrededor de la glia subperineurial para regular la difusión de metabolitos y moléculas grandes6,10,18,19. La formación de BBB se completa en 18,5 h después de la puesta de huevos (AEL) a 25 oC5,8. Estudios anteriores han identificado genes que son reguladores críticos de la formación BBB20,21,22. Para comprender mejor las funciones exactas de estos genes, es importante examinar el efecto de la mutación de estos reguladores potenciales en la integridad de bBB. Si bien estudios anteriores han esbozado enfoques para decir la integridad de BBB en embriones y larvas, aún no se ha descrito un protocolo integral para este ensayo5,7. Este protocolo paso a paso describe los métodos para decir la integridad de BBB durante las etapas embrionarias de D. melanogaster y la tercera etapa larval instar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona una descripción completa de los pasos necesarios para el ensayo para la integridad de BBB durante las etapas larantes de D. melanogaster de D. melanogaster. Se han descrito enfoques similares en otros lugares para probar la integridad del BBB durante el desarrollo, así como en las etapas adultas5,7,29,30. Sin embargo, las descripciones de los procedimientos…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. F. Bryan Pickett y al Dr. Rodney Dale por el uso de equipos para inyección. Este trabajo fue financiado por fondos de investigación de la Universidad Loyola de Chicago a M.D., D.T., y J.J.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
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