Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse
Summary
Kan-beyin bariyerbütünlüğü sinir sistemi fonksiyonu için çok önemlidir. Drosophila melanogasterolarak, kan-beyin bariyeri geç embriyogenez sırasında glial hücreler tarafından oluşur. Bu protokol, D. melanogaster embriyolarında ve üçüncü instar larvalarında kan-beyin bariyeri oluşumu ve bakımı için taht yöntemlerini açıklamaktadır.
Abstract
Uygun sinir sistemi gelişimi kan-beyin bariyerinin oluşumunu içerir, sıkı sinir sistemine erişimi düzenleyen ve toksinler ve patojenlerden nöral doku korur difüzyon bariyeri. Bu bariyerin oluşumundaki bozukluklar nöropatilerle ilişkilendirilmiştir ve bu bariyerin bozulması birçok nörodejeneratif hastalıkta gözlenmiştir. Bu nedenle, potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için kan-beyin bariyerinin oluşumunu ve bakımını düzenleyen genlerin belirlenmesi önemlidir. Bu genlerin nöral gelişimde tam rollerini anlamak için, değişmiş gen ekspresyonunun kan-beyin bariyerinin bütünlüğü üzerindeki etkilerini tetkik etmek gerekir. Kan-beyin bariyerinin kurulmasında işlev moleküllerin çoğu ökaryotik türler arasında korunmuş olduğu bulunmuştur, meyve sinek de dahil olmak üzere, Drosophila melanogaster. Meyve sinekleri sinir sistemi gelişimi ve işlevini düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için mükemmel bir model sistemi olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, D. melanogaster gelişiminin embriyonik ve larva evrelerinde kan-beyin bariyerinin bütünlüğünü test etmek için adım adım bir prosedürü tanımlar.
Introduction
Gelişim sırasında hücre-hücre iletişimi ve etkileşimleri doku ve organ yapısı nın ve fonksiyonunun kurulması açısından kritik öneme sahiptir. Bazı durumlarda, bu hücre-hücre etkileşimleri uygun organ fonksiyonu sağlamak için çevreden organları mühür. Bu kan-beyin bariyeri (BBB) tarafından izole edilir sinir sistemi için durumdur. İnsanlarda BBB disfonksiyonu epilepsi de dahil olmak üzere nörolojik bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, ve bariyerin arıza multipl skleroz ve amiyotrofik lateral skleroz dahil nörodejeneratif hastalıklarda gözlenmiştir1. Memelilerde, BBB endotel hücreleri arasında sıkı kavşaklar oluşur2,3. Meyve sineği Drosophila melanogaster de dahil olmak üzere diğer hayvanlar, glial hücrelerden oluşan bir BBB var. Bu glial hücreler besin, atık ürünler, toksinler ve sinir sistemi içine ve dışında büyük moleküllerin hareketini kontrol etmek için seçici geçirgen bir bariyer oluşturur4. Bu hareketlilik ve koordinasyon için izin, yangın eylem potansiyelleri için gerekli elektrokimyasal degrade bakım sağlar4. D. melanogaster, glia potasyum açısından zengin, kan gibi hemolenf5sinir sistemini korumak .
Merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik sinir sistemi (PNS) D. melanogaster, iki dış glial tabakalar, subperineurial glia ve perineurial glia, yanı sıra ekstrasellüler matriks bir dış ağ, nöral lamella, formu hemolenf-beyin ve hemolenf-sinir bariyeri6, Bu makale boyunca BBB olarak anılacaktır. Geliştirme subperineurial glia poliploid olur ve sinir sistemi5çevreleyen büyütmek 5,6,7,8,9,10,11 . Subperineurial glia form septate kavşaklar, hemolenf ve sinir sistemi arasında ana difüzyon bariyersağlamak5,6,12. Bu kavşaklar moleküler olarak omurgalılarda miyelinating glia paranodlarında bulunan septate benzeri kavşaklar benzer, ve memelilerin BBB sıkı kavşaklar olarak aynı işlevi gerçekleştirmek13,14, 15.000 , 16.02.20 , 17. Perineurial glia bölmek, büyümek, ve metabolitleri ve büyük moleküllerin difüzyon düzenlemek için subperineurial glia etrafında sarın6,10,18,19. BBB oluşumu 25 °C5,8’deyumurtlama (AEL) sonrası 18,5 saat tamamlanır. Önceki çalışmalarda BBBoluşumununkritik düzenleyicileri olan genler tespit 20,21,22. Bu genlerin tam rollerini daha iyi anlamak için, bu potansiyel düzenleyicilerin mutasyonunun BBB bütünlüğü üzerindeki etkisini incelemek önemlidir. Önceki çalışmalarda embriyo ve larvalarda BBB bütünlüğünü nitelemek için yaklaşımlar özetlenen olsa da, bu test için kapsamlı bir protokol henüz tarif edilmemiştir5,7. Bu adım adım protokol, D. melanogaster embriyonik ve üçüncü instar larva aşamalarında BBB bütünlüğünü nitretetmek için yöntemleri açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, Geç embriyonik ve D. melanogaster gelişiminin üçüncü instar larva aşamalarında BBB bütünlüğü için test etmek için gereken adımların kapsamlı bir açıklamasını sağlar. Benzer yaklaşımlar başka bir yerde geliştirme sırasında BBB bütünlüğünü titretmek için tarif edilmiştir, yanı sıra yetişkin aşamalarında5,7,29,30. Ancak, malzeme ve y?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar enjeksiyon için ekipman kullanımı için Dr F. Bryan Pickett ve Dr Rodney Dale teşekkür ederiz. Bu çalışma Loyola University Chicago’dan M.D., D.T., ve J.J.’e kadar araştırma fonu ile finanse edilmiştir.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
Referenzen
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin–novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- . BDSC Cornmeal Food Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017)
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetik. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Entwicklungsbiologie. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
