초파리 멜라노가스터의 혈액-뇌 장벽 무결성에 대한 분석
Summary
혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.
Abstract
적절한 신경계 발달에는 혈액-뇌 장벽의 형성, 신경계에 대한 접근을 엄격하게 조절하고 신경 조직을 독소와 병원체로부터 보호하는 확산 장벽이 포함됩니다. 이 장벽의 형성에 있는 결점은 신경병증과 상관되었습니다, 이 방벽의 고장은 많은 신경 퇴행성 질병에서 관찰되었습니다. 따라서, 잠재적인 치료 표적을 확인하기 위하여 혈액 두뇌 방벽의 대형 그리고 정비를 통제하는 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자가 신경 발달에서 하는 정확한 역할을 이해하기 위하여는, 혈액 두뇌 방벽의 무결성에 변경된 유전자 발현의 효력을 분석할 필요가 있습니다. 혈액-뇌 장벽의 확립에서 기능하는 많은 분자는 과일 파리, 초파리 멜라노가스터를포함한 진핵 종에 걸쳐 보존되는 것으로 밝혀졌다. 과일 파리는 신경계 발달과 기능을 조절하는 분자 메커니즘을 검사하기위한 훌륭한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 발달의 배아 및 애벌레 단계 도중 혈액 두뇌 방벽 무결성을 위한 분석하는 단계별 절차를 기술합니다.
Introduction
개발 하는 동안, 세포-세포 통신 및 상호 작용 조직 및 장기 구조 및 기능의 설립에 대 한 중요 한. 경우에 따라, 이러한 세포-세포 상호 작용 적절 한 장기 기능을 보장 하기 위해 주변 환경에서 장기를 밀봉. 이것은 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 의해 절연된 신경계의 경우입니다. 인간에서 BBB의 기능 장애는 간질을 포함한 신경 질환에 연결되었으며, 장벽의 붕괴는 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 신경 퇴행성 질환에서 관찰되었다1. 포유동물에서, BBB는 내피 세포2,3사이 단단한 접합에 의해 형성된다. 과일 플라이, 드로소필라 멜라노가스터를 포함한 다른 동물들은 신경교 세포로 구성된 BBB를 갖는다. 이러한 신경교 세포는 영양분, 노폐물, 독소 및 신경계 안팎으로 큰 분자의 움직임을 제어하기 위해 선택적으로 투과성 장벽을 형성한다4. 이를 통해 동작 전위를 발사하는 데 필요한 전기 화학 그라데이션의 유지 보수가 가능하여 이동성 및 조정4. D. 멜라노가스터에서,glia는 칼륨이 풍부하고 혈액과 같은 혈림프5에서신경계를 보호합니다.
D. melanogaster의중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS), 2 개의 외부 신경교 층, subperineurial glia 및 perineurial glia, 외세포 질, 신경 라멜라의 외부 네트워크, 형성 hemolymph-뇌 및 hemolymph 신경 장벽6,이 문서 전반에 걸쳐 BBB라고. 개발 중 피각증 신경교는 polyploid되고 신경계를 둘러싸고 확대5,6,7,8,9,10,11 . 헤모 림프와 신경계 사이의 주요 확산 장벽을 제공하는 심층 신경 교향곡 형태5,6,12. 이러한 접합부는 척추동물에서 골수성 신경교의 파라노드에서 발견되는 격막과 유사한 접합부와 분자적으로 유사하며, 포유류13,14의BBB에서 단단한 접합부와 동일한 기능을 수행합니다. 15세 , 16세 , 17. 대사 산물과 큰 분자의 확산을 조절하기 위해 회음구 신경교를 나누고, 성장시키고, 감싸는6,10,18,19. BBB 형성은 25 °C5,8에서계란 누워 (AEL) 후 18.5 시간에 의해 완료된다. 이전 연구는 BBB형성20,21,22의중요한 조절자인 유전자를 확인했습니다. 이 유전자의 정확한 역할을 더 잘 이해하기 위하여는, BBB 무결성에 이 잠재적인 기계레이터의 돌연변이의 효력을 검토하는 것이 중요합니다. 이전 연구는 배아와 애벌레에 있는 BBB 무결성을 분석하기 위한 접근을 설명하는 동안, 이 분석법을 위한 포괄적인 프로토콜은 아직5,7을기술되지않았습니다. 이 단계별 프로토콜은 D. melanogaster 배아 및 제 3 instar 애벌레 단계 도중 BBB 무결성을 분석하는 방법을 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 D. 멜라노가스터 발달의 후기 배아 및 제3 의 유충 단계 동안 BBB 무결성을 분석하는 데 필요한 단계에 대한 포괄적인 설명을 제공한다. 유사한 접근법은 성인5, 7,29,30뿐만아니라 개발 중에 BBB의 무결성을 분석하기 위해 다른 곳에서 기술되었다. 그러나 재료 및 방법 섹션의 절차에…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 주입을 위한 장비의 사용을 위한 박사 F. 브라이언 피켓 과 박사 로드니 데일 감사합니다. 이 작품은 로욜라 대학 시카고에서 M.D., D.T., J.J.에 연구 자금으로 지원되었다.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
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