Multi-Fiber Photometrie zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität bei frei beweglichen Tieren

Summary

In diesem Protokoll wird erläutert, wie Multifaserphotometrieaufzeichnungen implementiert und durchgeführt werden, wie Kalzium-unabhängige Artefakte korrigiert werden und wie wichtige Überlegungen für die duale Photometrie-Bildgebung berücksichtigt werden.

Abstract

Die Aufzeichnung der Aktivität einer Gruppe von Neuronen in einem frei beweglichen Tier ist ein schwieriges Unterfangen. Darüber hinaus wird es, da das Gehirn in kleinere und kleinere funktionelle Untergruppen zerlegt wird, von größter Bedeutung, aus Projektionen und/oder genetisch definierten Subpopulationen von Neuronen aufzuzeichnen. Fiber-Photometrie ist ein zugänglicher und leistungsstarker Ansatz, der diese Herausforderungen bewältigen kann. Durch die Kombination optischer und genetischer Methoden kann die neuronale Aktivität in tiefen Gehirnstrukturen gemessen werden, indem genetisch kodierte Kalziumindikatoren exexzessiert werden, die die neuronale Aktivität in ein optisches Signal übersetzen, das leicht messbar ist. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Komponenten eines Multifaser-Photometriesystems, wie man auf tiefe Gehirnstrukturen zugreift, um Licht zu liefern und zu sammeln, eine Methode, um Bewegungsartefakte zu berücksichtigen, und wie fluoreszierende Signale verarbeitet und analysiert werden. Das Protokoll beschreibt experimentelle Überlegungen bei der Durchführung von Einzel- und Dual-Farb-Bildgebung, entweder aus einzelnen oder mehreren implantierten Optischen Fasern.

Introduction

Die Fähigkeit, neuronale Reaktionen mit bestimmten Aspekten des Verhaltens eines Tieres zu korrelieren, ist entscheidend, um die Rolle zu verstehen, die eine bestimmte Gruppe von Neuronen bei der Leitung oder Reaktion auf eine Handlung oder einen Reiz spielt. Angesichts der Komplexität des Verhaltens von Tieren, mit den unzähligen inneren Zuständen und äußeren Reizen, die selbst die einfachsten Aktionen beeinflussen können, rüstet die Aufzeichnung eines Signals mit Einer-Versuchs-Auflösung die Forscher mit den notwendigen Werkzeugen aus, um diese zu überwinden. Einschränkungen.

Die Faserphotometrie ist für viele Forscher auf dem Gebiet der Systemneurowissenschaften aufgrund ihrer relativen Einfachheit im Vergleich zu anderen In-vivo-Aufnahmetechniken, ihrem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und der Fähigkeit, in einer Vielzahl von Verhaltensparadigmen^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Im Gegensatz zu herkömmlichen elektrophysiologischen Methoden ist die Photometrie der optische Ansatz, der am häufigsten in Verbindung mit genetisch kodierten Calciumindikatoren (GECIs, gCaMP-Serie)⁹verwendet wird. GECIs ändern ihre Fluoreszenzfähigkeit, je nach, ob sie an Kalzium gebunden sind oder nicht. Da die innere Konzentration von Kalzium in Neuronen sehr streng reguliert ist und spannungsgebundene Kalziumkanäle sich öffnen, wenn ein Neuron ein Aktionspotential abfeuert, erhöht sich die innere Kalziumkonzentration vorübergehend, was zu vorübergehenden Fähigkeit eines GECI zur Fluoreszenz, kann ein guter Proxy für neuronale^{Feuerung 9}sein.

Mit der Faserphotometrie wird das Anregungslicht eine dünne Multimode-Optikfaser ins Gehirn geleitet, und ein Emissionssignal wird durch dieselbe Faser wieder nach oben gesammelt. Da diese Glasfasern leicht und biegsam sind, kann sich ein Tier weitgehend ungehindert bewegen, was diese Technik mit einer Vielzahl von Verhaltenstests und -bedingungen kompatibel macht. Einige Bedingungen, wie schnelle Bewegungen oder das Biegen des Glasfaser-Patchkabels über den Radius hinaus, in dem es die gesamte interne Reflexion aufrechterhalten kann, können Signalartefakte einführen. Um Signalvon Rauschen zu verkennen, können wir eine Eigenschaft von GCaMP ausnutzen, die als “isosbestic point” bekannt ist. Kurz gesagt, mit GCaMP, da die Wellenlänge des Anregungslichts nach links verschoben wird, nimmt seine Emission im kalziumgebundenen Zustand ab und die Emission im Kalzium-ungebundenen Zustand nimmt geringfügig zu. Der Punkt, an dem die relative Intensität dieser beiden Emissionen gleich ist, wird als isosbestischer Punkt bezeichnet. Wenn GCaMP an dieser Stelle angeregt wird, wird seine Emission nicht durch Veränderungen der inneren Kalziumkonzentrationen beeinflusst, und die Varianz des Signals ist am häufigsten auf die Dämpfung des Signals durch Überbiegung des Glasfaser-Patchkabels oder die Bewegung des Neuronalgewebes zurückzuführen. relativ zur implantierten Faser.

Die Ein-Einheiten-Elektrophysiologie ist aufgrund ihrer einzelligen und Single-Spike-Level-Auflösung nach wie vor der Goldstandard für frei bewegliche In-vivo-Aufnahmen. Es kann jedoch schwierig sein, die molekulare Identität der zellen zu bestimmen, die aufgezeichnet werden, und die Post-hoc-Analyse kann ziemlich mühsam sein. Faserphotometrie hat zwar keine einzellige Auflösung, ermöglicht es Forschern jedoch, Fragen zu stellen, die mit herkömmlichen Techniken nicht angegangen werden können. Durch die Kombination viraler Strategien mit transgenen Tieren kann die Expression von GECIs auf genetisch definierte neuronale Typen gerichtet werden, um populations- oder projektionsdefinierte neuronale Aktivität aufzuzeichnen, die durch die Überwachung des Calciumsignals direkt am Axon durchgeführt werden kann. Klemmen^10,11. Darüber hinaus ist es durch die Implantation mehrerer faseroptischer Kanülen möglich, die neuronale Aktivität aus mehreren Hirnregionen und -wegen im selben Tier gleichzeitig zu überwachen^12,13.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine Technik für Einzel- und Multifaserphotometrie, wie man kalziumunabhängige Artefakte korrigiert und detailliert beschreibt, wie man mono- und dualfarbene Aufnahmen durchführt. Wir bieten auch Beispiele für die Arten von Fragen, die man stellen kann, und deren zunehmende Komplexität (siehe Abbildung 1). Das Faserphotometrie-Setup für Multifaseraufzeichnungen, die in diesem Protokoll detailliert sind, kann mithilfe einer Liste von Materialien erstellt werden, die unter https://sites.google.com/view/multifp/hardware (Abbildung 2) zu finden sind.

Es ist wichtig, dass das System sowohl für 410 nm als auch für 470 nm Anregungswellenlängen für kalziumunabhängige und kalziumabhängige Fluoreszenzemissionen aus GCaMP6 oder seinen Varianten ausgestattet ist. Für kundenspezifische Setups oder wenn keine Software zum Ausführen des Systems verfügbar ist, kann das kostenlose Open-Source-Programm Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) verwendet werden. Alternativ kann die Faserphotometrie über MATLAB (z.B. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)¹² oder eine andere Programmiersprache¹⁴ausgeführt werden. Die Software und Hardware des Systems sollte die Manipulation der 410 nm und 470 nm LEDs und der Kamera, die Extraktion von Bildern (Abbildung 2), und die Berechnung der mittleren Fluoreszenzintensität in den Bereichen von Interesse (ROIs) um die Fasern auf die Bilder. Der Ausgang sollte eine Tabelle mit mittleren Intensitätswerten sein, die mit den LEDs 470 nm und 410 nm von jeder Faser im Patchkabel aufgezeichnet werden. Bei Multifaserexperimenten können gebündelte Fasern mit 400 m die Bewegung von Mäusen einschränken. In solchen Fällen empfehlen wir die Verwendung von 200 m Patchkabeln, die mehr Flexibilität bieten. Es kann auch möglich sein, kleinere Dummy-Kabel während des Trainings von Mäusen zu verwenden.

Es ist entscheidend, in der Lage zu sein, Zeitpunkte für Ereignisse von Interesse während der Faserphotometrie-Erfassung zu extrahieren. Wenn das System nicht ohne weiteres ein integriertes System zur Integration von TTLs für bestimmte Ereignisse bereitstellt, besteht eine alternative Strategie darin, einzelnen aufgezeichneten Zeitpunkten einen Zeitstempel zuzuweisen, um sich an bestimmten Zeiten und Ereignissen während des Experiments auszurichten. Die Zeitstempelung kann mit der Computeruhr erfolgen.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Animal Care and Use Committees der University of California, San Diego, und dem Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und von der Université Laval Animal Protection genehmigt. ausschuß. 1. Ausrichtung des optischen Pfades zwischen der CMOS-Kamera (komplementärer Metalloxid-Halbleiter) und dem einzelnen oder verzweigten Patchkabel Lösen Sie alle Schrauben am 5-Achsen-Übersetzer (11…

Representative Results

Neuronale Korrelationen von Verhaltensreaktionen können je nach einer Vielzahl von Faktoren variieren. In diesem Beispiel haben wir die In-vivo-Faserphotometrie verwendet, um die Aktivität von Axonklemmen aus dem lateralen hypothalamischen Bereich (LHA) zu messen, die in der lateralen Hatula (LHb) enden. Wildtyp-Mäuse wurden mit einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) injiziert, das GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) in die LHA kodiert, und eine Optische Faser wurde mit der Spitze unmittelbar über dem LHb implantiert (<strong c…

Discussion

Die Faserphotometrie ist ein zugänglicher Ansatz, der es Forschern ermöglicht, Massenkalzium-Dynamiken von definierten neuronalen Populationen bei frei beweglichen Tieren aufzuzeichnen. Diese Methode kann mit einer Vielzahl von Verhaltenstests kombiniert werden, einschließlich “bewegungslastige” Aufgaben wie erzwungene Schwimmtests², Angstkonditionierung¹⁸, soziale Interaktionen^1,4und andere^{7 ,<…}

Materials

1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long	Thorlabs	SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long	Thorlabs	SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long	Thorlabs	SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable	Thorlabs	M59L01
12.7 mm Optical Post	Thorlabs	TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder	Thorlabs	PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube	Thorlabs	KPS101
20x objective	Thorlabs	RMS20X	#10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount	Thorlabs	CM1-DCH/M	#8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED	Doric Lenses	CLED_405	#2 in Figure 2
410 nm bandpass filter	Thorlabs	FB410-10	#5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED	Doric Lenses	CLED_465	#1 in Figure 2
470 nm bandpass filter	Thorlabs	FB470-10	#4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter	Semrock	FF01-560/14-25	#5 in Figure 5
560 nm LED	Doric Lenses	CLED_560	#1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount	Thorlabs	K5X1	#11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet	Thorlabs	AC254-035-A-ML	#7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator	Thorlabs	AD11F	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator	Thorlabs	AD127-F	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard	Thorlabs	MB1824
Clamping Fork	Thorlabs	CF125
Cube connector	Thorlabs	CM1-CC
Dual 493/574 dichroic	Semrock	FF493/574-Di01-25×36	#10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6	Semrock	FF01-535/22-25	#6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels	Thorlabs	XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining	Thorlabs	SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder	Thorlabs	SM1QP	#4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light	Thorlabs	F671SMA-405	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light	Thorlabs	F240SMA-532	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter	Semrock	FF01-520/35-25	In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera	Thorlabs	DCC3260M	#13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter	Neurophotometrics	SPLIT	#14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff	Thorlabs	DMLP425R	#8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff	Semrock	FF495-Di03	#9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement	C&B
M8 – M8 cable	Doric Lenses	Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas	Doric Lenses		Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords	Doric Lenses		Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter	Semrock	FF01-600/37-25	In light beam splitter
T7 LabJack	LabJack
T-cube LED Driver	Thorlabs	LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240	Thorlabs	CAB-DCU-T3