自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー
Summary
このプロトコルでは、マルチファイバーフォトメトリー記録の実装と実行方法、カルシウムに依存しないアーティファクトの修正方法、およびデュアルカラーフォトメトリイメージングに関する重要な考慮事項について詳しく説明します。
Abstract
自由に動く動物のニューロンのグループの活動を記録することは挑戦的な仕事です。さらに、脳がより小さく、より小さい機能サブグループに解剖されると、ニューロンの突起および/または遺伝的に定義された亜集団から記録することが最も重要になります。ファイバーフォトメトリーは、これらの課題を克服できるアクセス可能で強力なアプローチです。光学法と遺伝的方法論を組み合わせることで、遺伝子コード化されたカルシウム指標を発現させることで、脳の深部構造で神経活動を測定することができ、神経活動を簡単に測定できる光学信号に変換します。現在のプロトコルでは、マルチファイバーフォトメトリーシステムの構成要素、光を送受信する深層脳構造にアクセスする方法、モーションアーティファクトを考慮する方法、蛍光信号を処理および解析する方法について詳しく説明しています。このプロトコルは、単一または複数の埋め込み光ファイバから単一およびデュアルカラーイメージングを実行する際の実験的な考慮事項を詳述します。
Introduction
神経反応を動物の行動の特定の側面と相関させる能力は、特定のニューロングループが行動や刺激を指示または応答する際に果たす役割を理解するために重要です。動物の行動の複雑さを考えると、最も単純な行動にも影響を与える可能性のある無数の内部状態と外部刺激により、単一試用解像度で信号を記録すると、これらを克服するために必要なツールを研究者に提供します。制限。
ファイバーフォトメトリーは、生体内記録技術の他に比べて相対的なシンプルさ、高い信号対雑音比、および様々なシステム神経科学の分野で多くの研究者にとって選択の技術となっています。行動パラダイム1,2,3,4,5,6,7,8.従来の電気生理学的方法とは異なり、フォトメトリーは、遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI、GCaMPシリーズ)9と組み合わせて最も一般的に使用される光学的アプローチです。GECIsは、カルシウムに結合しているかどうかに基づいて蛍発性を変化させます。ニューロン中のカルシウムの内部濃度は非常に厳しく調節され、ニューロンが作用電位を発射すると電圧ゲートカルシウムチャネルが開くため、一過性の内部カルシウム濃度が増加し、蛍光に対するGECIの能力は、ニューロン発射9の良好なプロキシでありうる。
光ファイヤを使用すると、励起光は薄いマルチモードの光ファイバを脳に送り込み、発光信号を同じ繊維を通して回収します。これらの光ファイバは軽量で曲げ可能であるため、動物はほとんど妨げられずに移動することができ、この技術は、行動テストや条件の広い配列と互換性があります。光ファイバ パッチ コードの急速な動きや曲げなど、内部反射全体を維持できる半径を超える一部の条件では、信号アーティファクトが発生する可能性があります。ノイズからの信号を曖昧にするために、我々は「アイソスベストポイント」として知られているGCaMPのプロパティを利用することができます。簡単に言えば、GCaMPでは、励起光の波長が左にシフトするにつれて、カルシウム結合状態での発光が減少し、カルシウム非結合状態での放出がわずかに増加する。これら2つの放出の相対的強度が等しい点は、イソスベスティックポイントと呼べられている。GCaMPがこの時点で興奮すると、その発光は内部カルシウム濃度の変化の影響を受けず、信号の分散は、光ファイバパッチコードのオーバーベンディングまたは神経組織の動きによる信号の減衰が最も頻繁に起こる。埋め込まれた繊維に対して相対的である。
単一単位の電気生理学は単一細胞および単一スパイクのレベルの決断による生体内の記録で自由に動かすための金の標準である。しかし、記録されている細胞の分子的アイデンティティを特定することは困難であり、ポストホック分析は非常に面倒な場合があります。繊維フォトメトリーは単一細胞分解能を持たないが、研究者は従来の技術では対応できない質問をすることができます。ウイルス戦略とトランスジェニック動物を組み合わせることで、GECの発現は遺伝的に定義されたニューロン型に向けられ、集団または投影定義の神経活動を記録することができ、これは軸でカルシウムシグナルを直接モニタリングすることによって行うことができる。ターミナル10,11.さらに、複数の光ファイバーカニューレを埋め込むことにより、同じ動物12、13内の複数の脳領域および経路からの神経活動を同時に監視することができる。
本原稿では、単繊維およびマルチファイバーフォトメトリーの技術、カルシウムに依存しないアーティファクトの補正方法、モノカラーとデュアルカラーの記録の実行方法について説明する。また、質問の種類とその複雑さの増加レベルの例も示します (図 1参照)。このプロトコルで詳述されているマルチファイバー記録用の光メトリーセットアップは、https://sites.google.com/view/multifp/hardwareで見つかった材料のリストを使用して構築できます(図2)。
GCaMP6またはその変異体からのカルシウム依存性およびカルシウム依存性蛍光放出に対して、410 nmおよび470 nmの励起波長の両方にシステムを装備することが不可欠です。カスタムビルドのセットアップや、システムを実行するための利用可能なソフトウェアがない場合は、無料のオープンソースプログラムBonsai(http://www.open-ephys.org/bonsai/)を使用することができます。あるいは、ファイバーフォトメトリーは、MATLAB(例えば、https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12または他のプログラミング言語14を介して実行することができる。システムのソフトウェアとハードウェアは、410 nmと470 nmのLEDとカメラの両方の操作、画像の抽出(図2)、および繊維の周りに描かれた対象領域(ROI)の平均蛍光強度の計算を可能にする必要があります。画像。出力は、パッチ コード内の各ファイバから 470 nm および 410 nm LED で記録された平均強度値のテーブルである必要があります。マルチファイバー実験を行う場合、400μmの束化繊維はマウスの動きを制限してもよい。このような場合は、柔軟性を高める 200 μm パッチ コードを使用することをお勧めします。また、マウスの訓練中に小さなダミーケーブルを使用することも可能です。
ファイバーフォトメトリーの獲得時に、対象となる事象のタイムポイントを抽出できることが重要です。システムが特定のイベントに TTLL を統合するための組み込みシステムを容易に提供しない場合、別の方法として、テスト中に特定の時間とイベントに合わせて記録された個々のタイム ポイントにタイム スタンプを割り当てることを別の方法として使用します。タイムスタンプは、コンピュータクロックを使用して行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ファイバーフォトメトリーは、研究者が自由に動く動物の定義されたニューロン集団からバルクカルシウムダイナミクスを記録することを可能にするアクセス可能なアプローチです。この方法は、強制水泳テスト2、恐怖コンディショニング18、社会的相互作用1、4、および他7などの「運動重い」タスクを含む行動テストの…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC:RGPIN-2017-06131)からC.P.C.P.への助成金によって支援されました。我々はまた、この研究で使用されるウイルスベクターの生産のためのプレートフォルム・ドゥティルス・モレキュアレス(https://www.neurophotonics.ca/fr/pom)に感謝する。
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
Referenzen
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