SerbestÇe Hareket Eden Hayvanlarda Nöral AktiviteYi Kaydetmek Için Çoklu Fiber Fotometri
Summary
Bu protokol, çok fiberli fotometri kayıtlarının nasıl uygulanacağını ve gerçekleştirildirilebildiğini, kalsiyumdan bağımsız eserlerin nasıl düzeltilebildiğini ve çift renkli fotometri görüntüleme için önemli hususları ayrıntılarıyla anlatır.
Abstract
Serbestçe hareket eden bir hayvanda bir grup nöronların aktivitesini kaydetmek zorlu bir girişimdir. Ayrıca, beyin daha küçük ve daha küçük fonksiyonel alt gruplara bölündükçe, projeksiyonlardan ve/veya genetik olarak tanımlanmış nöronların alt popülasyonlarından kaydetmek çok önemli hale gelir. Fiber fotometri bu zorlukların üstesinden gelebilir erişilebilir ve güçlü bir yaklaşımdır. Optik ve genetik metodolojileri birleştirerek, nöral aktivite, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ifade edilerek derin beyin yapılarında ölçülebilir, bu da nöral aktiviteyi kolayca ölçülebilen bir optik sinyale dönüştürür. Mevcut protokol, çok fiberli fotometri sisteminin bileşenlerini, ışık teslim etmek ve toplamak için derin beyin yapılarına nasıl erişilmeyi, hareket yapılarını hesaba katmak için bir yöntem ve floresan sinyalleri nasıl işleyip analiz edileteceklerini ayrıntılarıyla anlatıyor. Protokol, tek veya birden fazla implante optik liflerden tek veya çift renkli görüntüleme yaparken deneysel hususları ayrıntılarıyla anlatır.
Introduction
Nöral tepkileri bir hayvanın davranışının belirli yönleriyle ilişkilendirme yeteneği, belirli bir nöron grubunun bir eylemi veya uyarıcıyı yönlendirmede veya yanıtlamada oynadığı rolü anlamak için önemlidir. Hayvan davranışının karmaşıklığı göz önüne alındığında, en basit eylemleri bile etkileyebilecek sayısız iç durum ve dış uyaran göz önüne alındığında, tek deneme çözünürlüğü ile bir sinyal kaydetmek araştırmacıları bu eylemlerin üstesinden gelmek için gerekli araçlarla donatır. Sınırlama.
Fiber fotometri, diğer in vivo kayıt teknikleri, yüksek sinyal-gürültü oranı ve çeşitli kayıt yeteneği ile karşılaştırıldığında göreceli basitliği nedeniyle sistem nörobilim alanında birçok araştırmacı için tercih edilen teknik haline gelmiştir davranış salk›r›mlar›1,2,3,4,5,6,7,8. Geleneksel elektrofizyolojik yöntemlerin aksine, fotometri en sık genetik kodlanmış kalsiyum göstergeleri ile birlikte kullanılan optik yaklaşımdır (GECIs, GCaMP serisi)9. GECIs kalsiyum bağlı olup olmadığını dayalı floresan yeteneklerini değiştirmek. Nöronlardaki kalsiyumun iç konsantrasyonu çok sıkı bir şekilde düzenlendiğinden ve bir nöron bir eylem potansiyeli ateşlediğinde voltaj kapılı kalsiyum kanalları açıldığından, iç kalsiyum konsantrasyonunda geçici artışlar meydana gelir ve bu da floresan bir GECI yeteneği, nöronal ateş için iyi bir proxy olabilir9.
Fiber fotometri ile uyarma ışığı beyne ince, çok modlu optik fiberden aşağı doğru yönlendirilir ve aynı lif aracılığıyla bir emisyon sinyali toplanır. Bu optik lifler hafif ve bükülebilir olduğundan, bir hayvan büyük ölçüde engelsiz hareket edebilir, davranış testleri ve koşulları geniş bir dizi ile uyumlu bu tekniği yapma. Hızlı hareketler veya fiber optik yama kablosunun toplam iç yansımayı koruyabileceği yarıçapın ötesinde bükülme gibi bazı koşullar, sinyal yapıtlarına neden olabilir. Sinyalin gürültüden uzakdur, “izosbestik nokta” olarak bilinen GCaMP özelliğinden yararlanabiliriz. Kısaca, GCaMP ile, uyarma ışığının dalga boyu sola kaydırıldıkça, kalsiyuma bağlı durumdaki salınımı azalır ve kalsiyum-bağlı olmayan durumdaki emisyon marjinal olarak artar. Bu iki emisyonun göreceli yoğunluğunun eşit olduğu nokta sisosbestik nokta olarak adlandırılmaktadır. GCaMP bu noktada heyecanlı olduğunda, emisyon iç kalsiyum konsantrasyonlarında değişiklikler etkilenmez, ve sinyal varyans en sık fiber optik yama kablosu veya nöral doku hareketi aşırı bükme gelen sinyalin zayıflaması nedeniyle implante fiber göreli.
Tek birimelektrofizyoloji, tek hücreli ve tek başak seviyesindeçözünürlüğü sayesinde in vivo kayıtları serbestçe hareket eden altın standarttır. Ancak, kaydedilen hücrelerin moleküler kimliğini saptamak zor olabilir ve post-hoc analizi oldukça zahmetli olabilir. Fiber fotometri tek hücreçözünürlüğü yok iken, araştırmacılar geleneksel teknikler ile ele almak imkansız sorular sormak için izin verir. Viral stratejilerin transgenik hayvanlarla birleştirilmesiyle, GECIs’in ekspresyonu, kalsiyum sinyalinin doğrudan aksonda izlenmesi yle yapilebilen popülasyon veya projeksiyon tanımlı nöral aktiviteyi kaydetmek için genetik olarak tanımlanmış nöronal tiplere yönlendirilebilir. terminalleri10,11. Ayrıca, birden fazla fiber optik kanüller implante ederek, aynı anda aynı hayvan12,13çeşitli beyin bölgeleri ve yolları nöral aktivite izlemek mümkündür.
Bu el yazmasında, tek ve çok fiberli fotometri için bir teknik, kalsiyumdan bağımsız eserler için nasıl düzeltilme ve mono-ve çift renkli kayıtların nasıl yapılacağını ayrıntılı olarak anlatacağız. Ayrıca, kişinin sormasını sağladığı soru türlerine ve artan karmaşıklık düzeylerine örnekler salıyoruz (bkz. Şekil 1). Bu protokolde ayrıntılı olarak yer alan çok fiberli kayıtlar için fiber fotometri kurulumu, https://sites.google.com/view/multifp/hardware bulunan malzemelerin bir listesi kullanılarak oluşturulabilir (Şekil 2).
Sistemin GCaMP6 veya varyantlarından kalsiyumbağımsız ve kalsiyuma bağımlı floresan emisyonu için hem 410 nm hem de 470 nm uyarma dalga boyları için donatılması esastır. Özel olarak oluşturulmuş kurulumlar için veya sistemi çalıştıracak kullanılabilir bir yazılım yoksa, ücretsiz, açık kaynak programı Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) kullanılabilir. Alternatif olarak, fiber fotometri MATLAB (örneğin, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 veya diğer programlama dili14üzerinden çalıştırılabilir. Sistemin yazılım ve donanım ı 410 nm ve 470 nm LED’lerin ve kameranın manipülasyonuna, görüntülerin çıkarılmasına(Şekil 2)ve liflerin etrafına çizilen ilgi bölgelerindeki ortalama floresan yoğunluğunun hesaplanmasına izin vermelidir. görüntüler. Çıkış, yama kablosundaki her bir elyaftan 470 nm ve 410 nm LED ile kaydedilen ortalama yoğunluk değerlerinin bir tablosu olmalıdır. Çok fiber deneyler yaparken, 400 μm paketlenmiş lifler farelerin hareketini sınırlayabilir. Bu gibi durumlarda, daha fazla esneklik sağlayan 200 μm yama kablosu kullanmanızı öneririz. Farelerin eğitimi sırasında daha küçük kukla kablolar kullanmak da mümkün olabilir.
Bu fiber fotometri edinimi sırasında ilgi olayları için zaman noktaları ayıklamak mümkün olmak çok önemlidir. Sistem belirli olaylar için TTL’leri tümleştirmek için yerleşik bir sistem sağlamazsa, alternatif bir strateji deneme sırasında belirli zaman ve olaylarla hizalamak için kaydedilen tek tek zaman noktalarına bir zaman damgası atamaktır. Zaman damgalama bilgisayar saati kullanılarak yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiber fotometri, araştırmacıların serbestçe hareket eden hayvanlarda tanımlanmış nöronal popülasyonlardan toplu kalsiyum dinamiği kaydetmelerine olanak tanıyan erişilebilir bir yaklaşımdır. Bu yöntem, zorunlu yüzme testleri 2 , korku-klima18, sosyaletkileşimler1,4, ve diğerleri7 gibi “hareket ağır” görevleri de dahil olmak üzere davranış testleri geniş bi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi’nin (RGPIN-2017-06131) C.P. C.P.’ye verdiği bir hibe ile desteklenmiştir. Ayrıca plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) bu çalışmada kullanılan viral vektörlerin üretimi için teşekkür ederiz.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
Referenzen
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
