Fotometria multifibra per registrare l'attività neurale in animali liberamente
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio come implementare ed eseguire registrazioni di fotometria multifibra, come correggere gli artefatti indipendenti dal calcio e considerazioni importanti per l’imaging di fotometria a doppio colore.
Abstract
Registrare l’attività di un gruppo di neuroni in un animale liberamente mobile è un’impresa impegnativa. Inoltre, poiché il cervello viene sezionato in sottogruppi funzionali sempre più piccoli, diventa fondamentale registrare da proiezioni e/o sottopopolazioni geneticamente definite di neuroni. La fotometria in fibra è un approccio accessibile e potente in grado di superare queste sfide. Combinando metodologie ottiche e genetiche, l’attività neurale può essere misurata in strutture cerebrali profonde esprimendo indicatori di calcio codificati geneticamente, che traducono l’attività neurale in un segnale ottico che può essere facilmente misurato. Il protocollo attuale descrive in dettaglio i componenti di un sistema di fotometria multifibra, come accedere alle strutture cerebrali profonde per fornire e raccogliere la luce, un metodo per tenere conto degli artefatti di movimento e come elaborare e analizzare i segnali fluorescenti. Il protocollo descrive in dettaglio le considerazioni sperimentali quando si esegue l’imaging a singolo e doppio colore, da fibre ottiche impiantate singole o multiple.
Introduction
La capacità di correlare le risposte neurali con aspetti specifici del comportamento di un animale è fondamentale per comprendere il ruolo che un particolare gruppo di neuroni svolge nel dirigere o rispondere a un’azione o uno stimolo. Data la complessità del comportamento animale, con la miriade di stati interni e stimoli esterni che possono influenzare anche le azioni più semplici, la registrazione di un segnale con risoluzione a prova singola dota i ricercatori degli strumenti necessari per superare questi Limitazioni.
La fotometria in fibra è diventata la tecnica di scelta per molti ricercatori nel campo delle neuroscienze dei sistemi a causa della sua relativa semplicità rispetto ad altre tecniche di registrazione in vivo, il suo elevato rapporto segnale-rumore e la capacità di registrare in una varietà di paradigmi comportamentali1,2,3,4,5,6,7,8. A differenza dei metodi elettrofisiologici tradizionali, la fotometria è l’approccio ottico più comunemente usato in combinazione con indicatori di calcio codificati geneticamente (GECI, la serie GCaMP)9. I CCIi cambiano la loro capacità di fluorescenza in base al fatto che siano legati o meno al calcio. Poiché la concentrazione interna di calcio nei neuroni è molto strettamente regolata e i canali di calcio legati alla tensione si aprono quando un neurone attiva un potenziale d’azione, aumenta la concentrazione interna di calcio, che si traduce in aumenti transitori capacità di un GECI di fluorescenza, può essere un buon proxy per la cottura neuronale9.
Con la fotometria in fibra, la luce di eccitazione viene diretta lungo una sottile fibra ottica multimodale nel cervello e un segnale di emissione viene raccolto attraverso la stessa fibra. Poiché queste fibre ottiche sono leggere e pieghevoli, un animale può muoversi in gran parte senza ostacoli, rendendo questa tecnica compatibile con una vasta gamma di test comportamentali e condizioni. Alcune condizioni, come i movimenti rapidi o la flessione del cavo patch in fibra ottica oltre il raggio in cui può mantenere la riflessione interna totale, possono introdurre artefatti del segnale. Per disambiguare il segnale dal rumore, possiamo sfruttare una proprietà di GCaMP nota come “punto isosbestico”. In breve, con GCaMP, mentre la lunghezza d’onda della luce di eccitazione viene spostata a sinistra, la sua emissione nello stato legato al calcio diminuisce e l’emissione nello stato non legato al calcio aumenta marginalmente. Il punto in cui l’intensità relativa di queste due emissioni è uguale è definita punto isosbestico. Quando GCaMP è eccitato a questo punto, la sua emissione non è influenzata da cambiamenti nelle concentrazioni interne di calcio, e la varianza nel segnale è più spesso dovuta all’attenuazione del segnale da sovraccarico del cavo patch in fibra ottica o movimento del tessuto neurale rispetto alla fibra impiantata.
L’elettrofisiologia a unità singola è ancora il gold standard per le registrazioni in vivo liberamente in movimento grazie alla sua risoluzione a cella singola e a picco singolo. Tuttavia, può essere difficile individuare l’identità molecolare delle cellule registrate e l’analisi post-hoc può essere abbastanza laboriosa. Mentre la fotometria in fibra non ha la risoluzione a cella singola, permette ai ricercatori di porre domande impossibili da affrontare con tecniche tradizionali. Combinando strategie virali con animali transgenici, l’espressione delle GeCI può essere diretta a tipi neuronali geneticamente definiti per registrare l’attività neurale definita dalla popolazione o dalla proiezione, che può essere eseguita monitorando il segnale di calcio direttamente all’assone terminali10,11. Inoltre, impiantando più cannule in fibra ottica, è possibile monitorare contemporaneamente l’attività neurale da diverse regioni e percorsi del cervello nello stesso animale12,13.
In questo manoscritto, descriviamo una tecnica per la fotometria singola e multifibra, come correggere artefatti indipendenti dal calcio e dettagliamo come eseguire registrazioni mono e doppio colore. Forniamo anche esempi dei tipi di domande che consente di porre e dei loro livelli crescenti di complessità (vedere Figura 1). La configurazione della fotometria in fibra per le registrazioni multifibra descritte in questo protocollo può essere costruita utilizzando un elenco di materiali trovati allhttps://sites.google.com/view/multifp/hardware (Figura 2).
È essenziale che il sistema sia equipaggiato sia per lunghezze d’onda di eccitazione di 410 e 470 nm per l’emissione di fluorescenza indipendente dal calcio e dal calcio da GCaMP6 o le sue varianti. Per le configurazioni personalizzate o se non c’è nessun software disponibile per eseguire il sistema, il programma open source gratuito Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) può essere utilizzato. In alternativa, la fotometria in fibra può essere eseguita attraverso MATLAB (ad esempio, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 o un altro linguaggio di programmazione14. Il software e l’hardware del sistema dovrebbero consentire la manipolazione di entrambi i LED da 410 nm e 470 nm e della telecamera, l’estrazione di immagini(Figura 2)e il calcolo dell’intensità media fluorescente nelle regioni di interesse (ROI) disegnate intorno alle fibre le immagini. L’output deve essere una tabella dei valori di intensità media registrati con i LED da 470 nm e 410 nm di ogni fibra nel cavo del cerotto. Quando si eseguono esperimenti multifibra, 400 m di fibre in bundle possono limitare il movimento dei topi. In questi casi, si consiglia di utilizzare cavi di patch da 200 m, che offrono maggiore flessibilità. Può anche essere possibile utilizzare cavi fittizi più piccoli durante l’allenamento dei topi.
È fondamentale essere in grado di estrarre i punti temporali per gli eventi di interesse durante l’acquisizione della fotometria in fibra. Se il sistema non fornisce facilmente un sistema integrato per integrare i TTL per eventi specifici, una strategia alternativa consiste nell’assegnare un timestamp ai singoli punti temporali registrati per allinearsi a orari ed eventi specifici durante l’esperimento. Il timestamp può essere fatto utilizzando l’orologio del computer.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fotometria in fibra è un approccio accessibile che consente ai ricercatori di registrare la dinamica del calcio sfuso da popolazioni neuronali definite in animali liberamente in movimento. Questo metodo può essere combinato con una vasta gamma di test comportamentali, tra cui attività “movimento pesante” come test di nuoto forzato2, paura-condizionamento18, interazioni sociali1,4, e altri7</s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) a C.P. C. P. è un chercheur-Boursier FRSQ. Ringraziamo anche il Plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) per la produzione dei vettori virali utilizzati in questo studio.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
Referenzen
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