Préparation d’extraits cellulaires par cryogrinding dans un moulin à congélateur automatisé

Summary

Nous décrivons une méthode fiable pour la préparation d’extraits de cellules entières de levure ou d’autres cellules à l’aide d’un moulin cryogénique qui minimise la dégradation et la dénaturation des protéines. Les extraits cellulaires conviennent à la purification des complexes protéiques fonctionnels, aux analyses protéomiques, aux études de co-immunoprécipitation et à la détection des modifications des protéines labiles.

Abstract

La facilité de la manipulation génétique et la forte conservation évolutive des machines cellulaires eucaryotes dans la levure naissante Saccharomyces cerevisiae en ont fait un organisme modèle génétique prééminent. Toutefois, comme l’isolement efficace des protéines dépend d’une perturbation optimale des cellules, l’utilisation de levure pour l’analyse biochimique des protéines cellulaires est entravée par sa paroi cellulaire qui est coûteuse à digérer enzymatiquement (à l’aide de lyticase ou de zymolyase), et difficile à perturber mécaniquement (à l’aide d’un batteur à perles traditionnel, d’une presse Français ou d’un moulin à café) sans provoquer de chauffage des échantillons, ce qui provoque à son tour la dénaturation et la dégradation des protéines. Bien que le broyage manuel des cellules de levure sous azote liquide (LN₂₎à l’aide d’un mortier et d’un pilon évite la surchauffe des échantillons, il est à forte intensité de main-d’œuvre et sujet à la variabilité de la lyse cellulaire entre les opérateurs. Pendant de nombreuses années, nous avons été avec succès la préparation d’extraits de levure de haute qualité en utilisant cryogrinding des cellules dans un moulin à congélateur automatisé. La température de -196 °C atteinte avec l’utilisation de LN₂ protège le matériel biologique contre la dégradation par les protéases et les nucléases, permettant la récupération de protéines intactes, d’acides nucléiques et d’autres macromolécules. Ici, nous décrivons cette technique en détail pour les cellules de levure en herbe qui consiste d’abord à congeler une suspension des cellules dans un tampon de lyse par son ajout dropwise dans LN_{2 pour} générer des gouttelettes congelées de cellules connues sous le nom de « pop-corn ». Ce maïs soufflé est ensuite pulvérisé sous LN₂ dans un moulin à congélateur pour produire un extrait congelé « en poudre » qui est décongelé lentement et clarifié par centrifugation pour enlever les débris insolubles. Les extraits qui en résultent sont prêts pour des applications en aval, telles que la purification des protéines ou des acides nucléiques, les analyses protéomiques ou les études de co-immunoprécipitation. Cette technique est largement applicable pour la préparation de l’extrait cellulaire à partir d’une variété de micro-organismes, tissus végétaux et animaux, spécimens marins, y compris les coraux, ainsi que l’isolement de l’ADN / ARN à partir de spécimens fossiles médico-légaux et pergélisol.

Introduction

La levure est un organisme modèle populaire pour les études protéiques, car il s’agit d’un organisme eucaryotique simple avec une abondance d’outils génétiques et biochimiques disponibles pour les^{chercheurs 1}. En raison de leur paroi cellulaire robuste, un défi auquel les chercheurs sont confrontés est de lyser efficacement les cellules sans endommager le contenu cellulaire. Différentes méthodes sont disponibles pour obtenir des extraits de protéines par la perturbation des cellules de levure qui comprennent la lyse enzymatique (zymolyase)^2,3, lyse^{chimique 4}, lyse physique par gel-dégel⁵, à base de pression (Français presse)^6,7, mécanique (perles de verre, moulin à café)^8,9, sonication à base de¹⁰ et cryogénique^2,11. L’efficacité de la lyse cellulaire et le rendement protéique peuvent varier considérablement selon la technique employée, affectant ainsi le résultat final ou l’adéquation pour l’application en aval désirée pour le lysate. Lorsque vous étudiez des protéines instables, qui ont des modifications posttranslationnelles fugaces ou qui sont sensibles à la température, il est particulièrement important d’utiliser une méthode qui minimisera la perte ou la dégradation de l’échantillon pendant la préparation.

Technique de préparation d’extrait	Détails	Avantages	Inconvénients	Analyse en aval	Référence
Français presse: Homogénéiseur haute pression (aka Microfluidizer) avec prétraitement enzymatique à l’aide de Zymolyase	Zymolyase-20T, homogénéiseur haute pression Microfluidizer. Le perturbateur se compose d’une pompe à haute pression à conduite d’air (rapport 1:250; pression d’air requise de 0,6 l MPa) et d’une chambre de perturbation spéciale avec une unité de pression arrière supplémentaire. Une taille minimale d’échantillon de 20 mL est requise pour le traitement.	La perturbation totale finale obtenue à l’aide du protocole combiné a approché 100 % avec 4 passes à une pression de 95 MPa, contre seulement 32 % de perturbations avec 4 passes à 95 MPa utilisant uniquement l’homogénéisation sans la Zymolyase.	Pas approprié pour les applications à petite échelle. Les enzymes peuvent devenir coûteuses pour les préparations à grande échelle.	Purification des protéines	6
Batteur de perles: Zymolyase cellules traitées lysed avec des perles de verre dans un instrument fastprep	Un volume à peu près égal de perles de verre froides, sèches et lavées à l’acide de 0,5 mm est ajouté à un volume donné de granulés cellulaires dans le tampon de lyse et les cellules sont perturbées par une agitation manuelle vigoureuse.	Il est particulièrement utile lors de la fabrication d’extraits de nombreuses petites cultures de levure différentes à des fins d’analyse plutôt que pour la purification des protéines.	Pendant la procédure de perle de verre, les protéines sont traitées sévèrement causant la mousse étendue menant à la dénaturation de protéine. La quantité de rupture cellulaire varie, tandis que la protéolyse ainsi que la modification des protéines peuvent résulter du chauffage de l’extrait au-dessus de 4 °C pendant la rupture mécanique.	Principalement des analyses d’ADN et d’ARN, mais aussi l’analyse des protéines par électrophéorèse de gel dénaturant, avec ou sans ballonnement occidental.	8
Traitement de zymolyase suivi d’une lyse utilisant une combinaison de choc osmotique et d’homogénéisation de Dounce	Après digestion enzymatique des parois cellulaires, les sphéoplastes sont lysés avec 15 à 20 coups d’un pilon moulant (dégagement de 1 à 3 μm) dans un homogénéisateur Dounce.	Avantageux d’utiliser des souches déficientes en protéase telles que BJ926 ou EJ101. C’est la façon la plus douce de briser les cellules de levure et, par conséquent, il est le plus approprié pour la préparation d’extraits qui peuvent effectuer des fonctions enzymatiques complexes (par exemple, traduction, transcription, réplication de l’ADN) et dans lequel l’intégrité des structures macromoléculaires (par exemple, ribosomes, épissures) doit être maintenue. Il est également utile pour isoler les noyaux intacts qui peuvent être utilisés pour des études de chromatine (Bloom et Carbon, 1982) ou pour des extraits de protéines nucléaires (Lue et Kornberg, 1987).	Les principaux inconvénients de la procédure de lyse sphéroplaste sont qu’il est relativement fastidieux et coûteux, en particulier pour les préparations à grande échelle (>10 litres), et les longues périodes d’incubation peuvent conduire à la protéolyse ou la modification des protéines.  Pour les préparations de chromatine, elles semblent être de qualité variable ou inférieure à celles produites par la centrifugation différentielle (basée sur l’intégrité de l’échelle nucléosome).	Isoler les noyaux intacts pour les études de chromatine, extraits qui peuvent effectuer des fonctions enzymatiques complexes, extraits nécessitant l’intégrité de structures macromoléculaires, extraits de protéines nucléaires.	2
Perturbation cellulaire des cellules congelées flash en broyant de l’azote liquide à l’aide d’un mortier ou d’un pilon ou d’un mélangeur	Les cellules sont congelées immédiatement dans de l’azote liquide, puis lysées en broyant manuellement dans un mortier à l’aide d’un pilon, ou à l’aide d’un mélangeur Waring en présence d’azote liquide.	Le protocole est rapide et facile. Il peut accueillir différentes quantités de cellules de levure, y compris de très grandes cultures. Son principal avantage est que les cellules sont prélevées immédiatement de l’état de croissance active dans l’azote liquide (−196 °C), diminuant les activités enzymatiques dégradantes telles que les protéases et les nucléases ainsi que les activités qui modifient les protéines (p. ex., phosphatases et kinases). Il est particulièrement adapté pour la fabrication d’extraits de cellules entières à partir d’une seule culture de levure pour la purification des protéines à grande échelle.	Un peu désordonné et potentiellement dangereux pour l’enquêteur négligent. Les petits échantillons (c.-à-d. les cultures de levure de 10 à 100 ml) ne sont pas faciles à traiter parce qu’il n’y a pas assez de masse de touffes de cellules congelées pour se fracturer efficacement dans le mélangeur. Il est long de traiter des échantillons individuels et de nettoyer l’équipement entre les utilisations.	Extraits de cellules entières d’une seule culture de levure pour la purification des protéines à grande échelle.	2
Autolyse, moulin à perles	pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min	Lyse rapide et efficace, en particulier pour la préparation d’extraits à petite échelle	La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules. Équipement de battement de perle requis.	Analyses à petite échelle.	10
Autolyse, Sonication	pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, puissance 80%	L’équipement de sonication est habituellement disponible dans la plupart des institutions.	La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules. Équipement de sonication requis. La lente lyse peut prendre plus de 24 heures.	Préparations de la paroi cellulaire de levure.
Processus d’ébullition et de gel-dégel	Aucun équipement spécialisé n’était nécessaire autre qu’un congélateur standard et un bloc chauffant ou un bain d’eau chaude.	Efficace, reproductible, simple et peu coûteux.	La production de chaleur conduit à la dénaturation et à la dégradation des macromolécules.	Analyses ADN par PCR.	5

Tableau 1 : Comparaison des méthodes disponibles pour la préparation des extraits de levure.

Le cryogrinding (aka cryogrinding(broyage cryogénique/fraisage cryogénique) est couramment utilisé pour récupérer les acides nucléiques, les protéines ou les produits chimiques à partir d’échantillons sensibles à la température d’une manière fiable pour des analyses quantitatives ou qualitatives. Il a été utilisé avec succès pour de multiples applications dans divers domaines, y compris la biotechnologie, la toxicologie, la médecine^{légale 12,13}, les sciences de l’environnement, la biologie végétale¹⁴ et les sciences alimentaires. L’isolement des macromolécules biologiques intactes dépend généralement de façon critique de la température. Des températures extrêmement basses garantissent que les protéases et les nucléases restent inactives, ce qui entraîne un isolement fiable des protéines intactes, des acides nucléiques et d’autres macromolécules pour des analyses ultérieures. En effet, un moulin à congélateur maintient généralement une température d’échantillon de -196 °C (le point d’ébullition du LN_2),minimisant ainsi la dénaturation et la dégradation de l’ADN/ARN ou des protéines.

L’usine de congélation utilise une chambre de broyage électromagnétique qui déplace rapidement une barre métallique solide ou un cylindre dans un flacon contenant l’échantillon à pulvériser entre les bouchons d’extrémité en acier inoxydable. L’instrument crée et inverse rapidement un champ magnétique dans la chambre de broyage. Au fur et à mesure que le champ magnétique se déplace d’avant en arrière, l’aimant écrase l’échantillon contre les bouchons, réalisant ainsi la « cryogrinding » et la pulvérisation du maïs soufflé. L’usine de congélation remplace le mortier et le pilon et permet le traitement séquentiel de plusieurs échantillons (ou jusqu’à 4 échantillons plus petits simultanément) par une reproduction élevée et évite la variabilité utilisateur-utilisateur associée au broyage manuel. Une fois les échantillons traités, les extraits cellulaires peuvent être utilisés pour une variété d’applications en aval.

Protocol

1. Préparation de maïs soufflé à levures Cultiver des cellules de levure dans 0,5 L de médias YPD à une densité de 1 x 107 cellules /mL. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur Coulter ou de tout autre moyen. Cellules centrifugeuses pendant 10 min à 2 400 g et 4 °C. Lavez chaque échantillon une fois avec 500 mL d’eau glacée déionisée de 18 méga Ohm Milli-Q. Resuspendez les granulés dans 15 mL de tampon de lyse glacée [20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 11…

Representative Results

Nous avons comparé deux méthodes différentes pour la lyse cellulaire de levure, à savoir le mouture de perle de verre à 4 °C et une méthode automatisée de cryogrinding à -196 °C, pour évaluer les protéines relatives de récupération dans les extraits cellulaires préparés avec les deux méthodes. Pour cette étude, nous avons choisi d’utiliser une souche de levure en herbe YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi …

Discussion

Une limitation de l’étude des protéines indigènes de la levure est la lyse inefficace des cellules de levure en raison de leur paroi cellulaire dure. Bien que plusieurs méthodes aient été développées, la méthode la plus cohérente et efficace dans nos mains est le cryogrinding des cellules de levure flash congelés comme pop-corn. Cette méthode permet la préparation fiable d’extraits de cellules entières de haute qualité de levure en herbe par rapport à d’autres méthodes de lyse. Les résultats repr?…

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps	Beckman	357002	Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract	BD Biosiences	212750	Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge	Beckman	B38624	High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous	MP Biomedicals	901521	Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Refrigerated centrifuge
Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Volume excluder and cryoprotectant
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 antibody	Novagen	70796	Antibody for HIS tag
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Salt for maintaining ionic strength
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32957	Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Protein Stain
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32963	Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Sodium Butyrate	EM Science	BX2165-1	Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S6521	Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate	MP Biomedicals	159664	Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill	SPEX Sample Prep	6850	Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin	BD Biosiences	635502	For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Reducing agent