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Biologie

자동 냉동고 밀에서 냉동 분쇄에 의한 세포 추출물 준비

Published: January 29, 2021
doi:
10.3791/61164
, , , ,
1Department of Biomedical Sciences,Florida State University College of Medicine

Summary

우리는 단백질의 분해 및 분해를 최소화하는 극저온 냉동고 밀을 사용하여 효모 또는 다른 세포에서 온전세포 추출물의 제조를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 세포 추출물은 기능성 단백질 복합체의 정화, 프로테오믹 분석, 공동 면역 침전 연구 및 음순 단백질 수정의 검출에 적합합니다.

Abstract

유전자 조작의 용이성과 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 진핵 세포 기계의 강한 진화 적 보존은 저명한 유전 모델 유기체를 만들었습니다. 그러나 효율적인 단백질 절연은 세포의 최적의 중단에 달려 있기 때문에 세포 단백질의 생화학 적 분석을위한 효모의 사용은 효소적으로 소화하는 데 비용이 많이 드는 세포 벽 (lyticase 또는 zymolyase 사용)에 의해 방해되며, 기계적으로 중단하기 어렵고 (전통적인 비터, 프랑스 프레스 또는 커피 분쇄기를 사용하여) 시료의 가열을 유발하지 않고 단백질 분해를 유발합니다. 모르타르와 유봉을 사용하여 액체 질소 (LN2)에서효모 세포의 수동 연삭은 시료의 과열을 방지하지만, 작업자 사이의 세포 용해의 가변성에 따라 노동 집약적이며 변동이 적용됩니다. 수년 동안 우리는 자동화된 냉동고 공장에서 세포의 극저온 분쇄를 사용하여 고품질 효모 추출물을 성공적으로 준비해 왔습니다. LN2의 사용으로 달성된 -196°C의 온도는 프로테아제 및 뉴클레아제에 의한 분해로부터 생물학적 물질을 보호하여 그대로 단백질, 핵산 및 기타 거대 분자의 회수를 허용합니다. 여기서 우리는 “팝콘”으로 알려진 세포의 냉동 액적을 생성하기 위해 LN2에 드롭 와이즈 추가를 통해 처음으로 리시스 버퍼에서 세포의 현탁액을 동결 포함 신진 효모 세포를 위해 자세히이 기술을 설명합니다. 이 팝콘은 냉동고 밀에서 LN2 에서 분쇄되어 천천히 해동되고 원심분리에 의해 명확히 하여 불용성 이물질을 제거합니다. 결과 추출물은 단백질 또는 핵산 정제, 프로테오믹 분석 또는 공동 면역 침전 연구와 같은 다운스트림 응용 분야에 대한 준비가 되어 있습니다. 이 기술은 다양한 미생물, 식물 및 동물 조직, 산호를 포함한 해양 표본뿐만 아니라 법의학 및 퍼머 프로스트 화석 표본에서 DNA / RNA를 분리하는 세포 추출물 준비에 널리 적용됩니다.

Introduction

효모는 단백질 연구를 위한 인기 있는 모형 유기체입니다, 연구원을 위해 유효한 유전 및 생화확적인 공구의 풍부를 가진 간단한 진핵 생물이기 때문에1. 그들의 튼튼한 세포 벽 때문에, 연구원이 직면하는 한 가지 도전은 세포 내용을 손상시키지 않고 효율적으로 세포를 lysing에 있습니다. 다른 방법은 효소 용해 (zymolyase)2,3,화학 용해4,동결 해동5, 압력 기반 (프랑스 프레스)6,7,기계 (유리 구슬, 커피 분쇄기)8,9,초음파 기반10 및 cryogenic2,11을포함하는 효모 세포의 중단을 통해 단백질 추출물을 얻을 수 있습니다. 세포 용해및 단백질 수율의 효율은 채택된 기술에 따라 상당히 달라질 수 있으므로 용액에 대한 원하는 다운스트림 적용에 대한 최종 결과 또는 적합성에 영향을 미칩니다. 불안정한 단백질을 연구할 때, 번역 후 잠시 변형이 있거나 온도에 민감하며, 준비하는 동안 시료 손실이나 저하를 최소화하는 방법을 사용하는 것이 특히 중요합니다.

추출 준비 기술 세부 정보 장점 단점 다운스트림 분석 참조
프랑스 언론: Zymolyase를 사용하여 효소 전처리를 하는 고압 균질화제(일명 미세유체제) Zymolyase-20T, 미세 유체화기 고압 균질화제. 파괴기는 공기 구동, 고압 펌프 (비율 1:250; 필요한 기압 0.6-l MPa)와 추가 역압 장치가있는 특수 중단 챔버로 구성됩니다. 처리하려면 최소 샘플 크기가 20mL입니다. 결합 된 프로토콜을 사용하여 얻은 최종 총 중단은 Zymolyase없이 균질화를 사용하여 95 MPa에서 4 패스로 32 %의 중단과 비교하여 95 MPa의 압력에서 4 패스로 100 %에 접근했습니다. 소규모 응용 프로그램에는 적합하지 않습니다. 효소는 대규모 준비를 위해 비싸지 않습니다. 단백질 정제 6
비드 비터 : 빠른 준비 기기에서 유리 구슬로 lysed Zymolyase 처리 된 세포 대략 감기, 건조, 산 세척 0.5mm 유리 구슬의 동일한 볼륨은 용해 완충제에 있는 세포 펠릿의 주어진 부피에 추가되고 세포는 격렬한 수동 동요에 의해 중단됩니다. 단백질 정화보다는 의도적으로 많은 다른 작은 효모 배양에서 추출하는 것이 특히 유용합니다. 유리 비드 시술 동안 단백질은 단백질 성변으로 이어지는 광범위한 발포를 유발하는 가혹하게 치료됩니다. 세포 파손의 양은 다양하지만, 단백질의 프로테오분해뿐만 아니라 변형은 기계적 파손 시 4°C 이상의 추출물의 가열로 인해 발생할 수 있습니다. 주로 DNA & RNA 분석, 하지만 또한 젤 전기 전화제를 데스팅 하 여 단백질 분석, 또는 서양 얼룩 없이. 8
삼투성 충격과 두드러기 균질화의 조합을 사용하여 용해다음 Zymolyase 치료 세포벽의 효소 소화 후, 구엽세포는 Dounce 균질화에서 15~20스트로크의 타이트한 유봉(클리어런스 1~ 3 μm)으로 분해됩니다. BJ926 또는 EJ101과 같은 프로테이즈 결핍 균주를 사용하는 것이 유리합니다. 이것은 효모 세포를 분해하는 가장 부드러운 방법이며 따라서 복잡한 효소 기능 (예를 들어, 번역, 전사, DNA 복제)을 수행 할 수있는 추출물을 준비하는 데 가장 적합하며 거시 분자 구조 (예 : 리보솜, 스플리솜)의 무결성을 유지해야합니다. 또한 크로마틴 연구(블룸 앤 카본, 1982) 또는 핵 단백질 추출물(Lue and Kornberg, 1987)에 사용할 수 있는 온전한 핵을 분리하는 데도 유용합니다. 구형 세포 용해 절차의 주요 단점은 상대적으로 지루하고 비싸다는 것입니다, 특히 대규모 제제 (>10 리터), 긴 잠복기간은 proteolysis 또는 단백질 수정으로 이어질 수 있습니다.  크로마틴 제제의 경우, 차동 원심분리에 의해 생성된 품질보다 다양하거나 낮은 품질(뉴클레오터 래더 무결성기준)이 있는 것으로 보입니다. 크로마틴 연구를 위한 손상되지 않은 핵 분리, 복잡한 효소 기능을 수행할 수 있는 추출물, 의 무결성을 요구하는 추출물
거대 분자 구조, 핵 단백질 추출물.		 2
박격포/유봉 또는 블렌더를 사용하여 액체 질소에서 분쇄하여 플래시 냉동 세포의 세포 중단 세포는 액체 질소에서 즉시 동결된 다음 유봉을 사용하여 모르타르에서 수동으로 연마하거나 액체 질소가 있는 동안 워링 블렌더를 사용하여 용액을 제거합니다. 프로토콜은 빠르고 쉽습니다. 그것은 매우 큰 배양을 포함하여 효모 세포의 다양한 양을 수용할 수 있습니다. 그것의 주요 장점은 세포가 액체 질소로 적극적으로 성장하는 상태에서 즉시 취한다는 것입니다 (−196°C), 단백질을 수정하는 활동뿐만 아니라 프로테아제와 뉴클레아제와 같은 분해 효소 활동뿐만 아니라 단백질 (예를 들어, 인산염 및 키나아제). 그것은 대규모 단백질 정제를 위한 단 하나 효모 배양에서 전세포 추출물을 만들기에 특히 적합합니다. 조금 지저분하고 부주의 한 수사관에게 잠재적으로 위험합니다. 작은 샘플(즉, 10-100ml 효모 배양)은 블렌더에서 효과적으로 골절할 수 있는 냉동 세포 덩어리의 질량이 충분하지 않기 때문에 쉽게 처리되지 않습니다. 개별 샘플을 처리하고 사용 사이의 장비를 청소하는 데 시간이 많이 걸립니다. 대규모 단백질 정제를 위한 단일 효모 배양에서 온전세포 추출물. 2
자동 분리, 비드 밀 pH 5.0, 50°C, 24시간, 200rpm/Ø 0.5mm, 5× 3분/3분 특히 소규모 추출물 준비를 위한 빠르고 효율적인 용해 열 생성은 거대 분자의 분해 및 저하로 이어집니다. 비드 구타 장비가 필요합니다. 소규모 분석. 10
자동 변기, 초음파 처리 pH 5.0, 50°C, 24시간, 200rpm, 4× 5분/2분, 펄스80%, 파워 80% 초음파 처리 장비는 일반적으로 대부분의 기관에서 사용할 수 있습니다. 열 생성은 거대 분자의 분해 및 저하로 이어집니다. 초음파 장치 필요. 느린 리시스는 24 시간 이상 걸릴 수 있습니다. 효모 세포 벽 준비.
끓는 및 동결 해동 공정 표준 냉동고와 난방 블록 또는 온수 욕조 이외에는 특수 장비가 필요하지 않습니다. 효율적이고, 재현 가능하며, 간단하고 저렴합니다. 열 생성은 거대 분자의 분해 및 저하로 이어집니다. PCR에 의한 DNA 분석. 5

표 1: 효모 추출물의 제조에 사용할 수 있는 방법의 비교.

극저온 분쇄(일명 극저온 분쇄/극저온 밀링)는 일반적으로 정량적 또는 질적 분석을 위해 신뢰할 수 있는 방식으로 온도에 민감한 샘플에서 핵산, 단백질 또는 화학 물질을 회수하는 데 사용됩니다. 생명 공학, 독물학, 법의학12,13,환경 과학, 식물 생물학14 및 식품 과학을 포함한 다양한 분야에서 여러 응용 분야에 성공적으로 사용되었습니다. 손상되지 않은 생물학적 거대 분자의 격리는 일반적으로 온도에 매우 의존합니다. 극히 낮은 온도로 프로테아제와 뉴클레아제가 비활성 상태를 유지하여 후속 분석을 위해 손상되지 않은 단백질, 핵산 및 기타 거대 분자를 안정적으로 분리합니다. 실제로, 냉동고 공장은 전형적으로 -196°C(LN2의비등점)의 시료 온도를 유지하므로 DNA/RNA 또는 단백질 분해 및 분해를 최소화한다.

냉동고 공장은 스테인레스 스틸 엔드 플러그 사이에 분쇄될 시료를 포함하는 유리병 내에서 고체 금속 막대 또는 실린더를 앞뒤로 빠르게 이동하는 전자기 분쇄 챔버를 사용합니다. 계측기는 연삭 챔버 내에서 자기장을 생성하고 빠르게 반전시깁니다. 자기장이 앞뒤로 이동함에 따라 자석은 플러그에 대한 샘플을 분쇄하여 ‘냉동 분쇄’와 팝콘의 분쇄를 달성합니다. 냉동고 밀은 모르타르와 유봉을 대체하고 여러 샘플(또는 최대 4개의 작은 샘플)을 높은 재현성으로 순차적으로 처리할 수 있게 해주며 수동 연삭과 관련된 사용자 간 가변성을 방지합니다. 샘플이 처리되면 셀 추출물을 다양한 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 효모 팝콘 준비 YPD 매체의 0.5 L에서 효모 세포를 1 x 107 세포/mL의 밀도로 성장시다. 쿨터 카운터 또는 다른 수단을 사용하여 셀을 계산합니다. 원심분리기 세포는 2,400g 및 4°C에서 10분 동안. 각 샘플을 얼음냉이 500mL로 1회 세척하여 18메가 옴 밀리-Q 수로 세척합니다. 얼음차가운 리시스 버퍼 15mL의 펠릿 재연 [20m HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0.1% 트웬, 10% 글리세롤, ?…

Representative Results

효모 세포 용해, 즉 유리 비드 밀링에 대한 두 가지 다른 방법, 즉 4°C에서 유리 비드 밀링 및 -196°C의 자동 냉동 분쇄 방법을 비교하여 두 가지 방법으로 제조된 세포 추출물의 상대적 회수 단백질을 평가하였다. 이 연구를 위해, 우리는 신진 효모 균주 YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2:ura3 ubi3-Δ2:ura3 ubi3-Δub-2.2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB221]) 16 [pUB221])…

Discussion

효모에서 토착 단백질을 연구하는 한계는 그들의 힘든 세포 벽 때문에 효모 세포의 비효율적인 lysis입니다. 여러 가지 방법이 개발되었지만, 우리 손에 가장 일관되고 효율적인 방법은 팝콘으로 얼어 붙은 효모 세포의 냉동 분쇄입니다. 이 방법은 다른 용해 방법에 비해 신진 효모에서 고품질 전세포 추출물의 신뢰할 수있는 준비를 할 수 있습니다. 대표적인 결과는 저온분쇄가 4°C(도<strong class="xf…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

군얀 연구소의 연구는 국립 보건 원, 국립 과학 재단 및 플로리다 보건부의 자금 지원을 받고 있습니다. 우리는 기술 지원을 학부 학생 존 파커 감사합니다.

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps Beckman 357002 Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone BD Biosiences 211677 Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract BD Biosiences 212750 Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge Beckman B38624 High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000 Beckman 366754 Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous MP Biomedicals 901521 Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44 Eppendorf 22637461 Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R Eppendorf 22625101 Refrigerated centrifuge
Glycerol SIGMA-ALDRICH G5150-1GA Volume excluder and cryoprotectant
HEPES FisherBiotech BP310-100 Buffer
HIS6 antibody Novagen 70796 Antibody for HIS tag
KCl SIGMA-ALDRICH P9541-1KG Salt for maintaining ionic strength
MG-132 CALBIOCHEM 474790 Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail ThermoFisher Scientific A32957 Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S SIGMA P7170-1L Protein Stain
Protease inhibitor cocktail ThermoFisher Scientific A32963 Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500 Beckman JLA 25.500 Rotor
Sodium Butyrate EM Science BX2165-1 Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S6521 Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate MP Biomedicals 159664 Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate Alfa Aesar 13408-09-8 Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill SPEX Sample Prep 6850 Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin BD Biosiences 635502 For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20 VWR International VW1521-07 Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol AMRESCO M131-250ML Reducing agent
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Referenzen

  1. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  2. Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
  3. Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast. Gene. 42 (2), 169-173 (1986).
  4. Nandakumar, M. P., Marten, M. R. Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins. Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).
  5. Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification. Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).
  6. Baldwin, C., Robinson, C. W. Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization. Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).
  7. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  8. Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. I. Rapid purification of yeast mitochondrial DNA in high yield. Biochimica et Biophysica Acta. 610 (2), 221-228 (1980).
  9. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
  10. Bzducha-Wróbel, A., et al. Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for β-glucan isolation. Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).
  11. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  12. Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. M. A systematic approach to the sampling of dental DNA. Journal of Forensic Sciences. 38 (5), 1194-1209 (1993).
  13. Sweet, D., Hildebrand, D. Recovery of DNA from human teeth by cryogenic grinding. Journal of Forensic Sciences. 43 (6), 1199-1202 (1998).
  14. Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Dean, J. F. An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species. Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).
  15. Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).
  16. Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Paik, J., Gunjan, A. Histone levels are regulated by phosphorylation and ubiquitylation-dependent proteolysis. Nature Cell Biology. 11 (8), 925-933 (2009).
  17. Liang, D., Burkhart, S. L., Singh, R. K., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Histone dosage regulates DNA damage sensitivity in a checkpoint-independent manner by the homologous recombination pathway. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9604-9620 (2012).
  18. Singh, R. K., Gonzalez, M., Kabbaj, M. H., Gunjan, A. Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).
  19. Gunjan, A., Verreault, A. A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae. Cell. 115 (5), 537-549 (2003).
  20. Gill, P., et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).
  21. Alain, K., et al. DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).
  22. Mohammad, F., Buskirk, A. Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria. Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).
  23. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).
  24. Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods. BMC Biochem. 5 (14), (2004).
  25. Grant, L. J., et al. Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation. Food & Function. 11 (1), 834-845 (2020).
  26. Lolo, M., et al. Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).
  27. Santos, D., et al. Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).
  28. da Silva, E. G. P., et al. Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples. Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).
  29. Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).
  30. Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).
  31. Nielsen-Marsh, C. M., et al. Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka. Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).

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Keywords: Yeast Cell LysisCryogrindingAutomated Freezer MillProtein ExtractionNative Protein IsolationMacromolecule ExtractionPhysical Lysis MethodsTemperature-sensitive LysisEnzymatic Lysis LimitationsChemical Lysis LimitationsFrench PressMortar And PestleBead Beater MillSonicationHeat GenerationProtein DenaturationProtein Degradation
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Phillips, E. O. N., Giovinazzi, S., Menz, S. L., Son, Y., Gunjan, A. Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill. J. Vis. Exp. (167), e61164, doi:10.3791/61164 (2021).
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