Preparación de extractos celulares mediante criogrinding en un molino congelador automatizado

Summary

Describimos un método confiable para la preparación de extractos de células enteras a partir de levadura u otras células utilizando un molino congelador criogénico que minimiza la degradación y desnaturalización de proteínas. Los extractos celulares son adecuados para la purificación de complejos proteómicos funcionales, análisis proteómicos, estudios de inmunoprocipitación y detección de modificaciones de proteínas lábiles.

Abstract

La facilidad de manipulación genética y la fuerte conservación evolutiva de la maquinaria celular eucariota en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae la ha convertido en un organismo modelo genético preeminente. Sin embargo, dado que el aislamiento eficiente de las proteínas depende de una interrupción óptima de las células, el uso de levadura para el análisis bioquímico de las proteínas celulares se ve obstaculizado por su pared celular, que es costosa de digerir enzimáticamente (usando lyticase o zymolyase), y difícil de interrumpir mecánicamente (usando un batidor de cuentas tradicional, una prensa francesa o una trituradora de café) sin causar calentamiento de muestras, lo que a su vez causa denatura y degradación de proteínas. Aunque la molienda manual de células de levadura bajo nitrógeno líquido (LN₂) utilizando un mortero y un peste evita el sobrecalentamiento de las muestras, es intensiva en mano de obra y está sujeta a variabilidad en la lisis celular entre los operadores. Durante muchos años, hemos estado preparando con éxito extractos de levadura de alta calidad utilizando criogrinding de células en un molino congelador automatizado. La temperatura de -196 oC alcanzada con el uso de LN₂ protege el material biológico de la degradación por proteasas y nucleasas, permitiendo la recuperación de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas. Aquí describimos esta técnica en detalle para las células de levadura en ciernes que implica primero congelar una suspensión de células en un tampón de lisis a través de su adición por gotas en LN₂ para generar gotas congeladas de células conocidas como “palomitas de maíz”. Estas palomitas de maíz se pulverizan bajo LN₂ en un molino congelador para generar un extracto congelado “en polvo” que se descongela lentamente y se clarifica por centrifugación para eliminar los desechos insolubles. Los extractos resultantes están listos para aplicaciones posteriores, como purificación de proteínas o ácidos nucleicos, análisis proteómicos o estudios de inmunoprocipitación. Esta técnica es ampliamente aplicable para la preparación de extractos celulares de una variedad de microorganismos, tejidos vegetales y animales, especímenes marinos incluyendo corales, así como el aislamiento de ADN / ARN de especímenes fósiles forenses y permafrost.

Introduction

La levadura es un organismo modelo popular para los estudios de proteínas, ya que es un organismo eucariota simple con una abundancia de herramientas genéticas y bioquímicas disponibles para los investigadores^1. Debido a su robusta pared celular, un desafío que enfrentan los investigadores es en la eliminación eficiente de las células sin dañar el contenido celular. Se dispone de diferentes métodos para la obtención de extractos proteicos mediante la interrupción de las células de levadura que incluyen lisis enzimática (zymolyase)^2,3, lisis química⁴, lisis física por congelación-descongelación⁵, a presión (prensa francesa)^6,7, mecánica (perlas de vidrio, molinillo de café)^8,9, basado en sonicación¹⁰ y criogénico^2,11. La eficiencia de la lysis celular y el rendimiento proteico pueden variar considerablemente dependiendo de la técnica empleada, afectando así al resultado final o a la idoneidad para la aplicación posterior deseada para el alsate. Al estudiar proteínas que son inestables, tienen modificaciones posttranslacionales fugaces, o son sensibles a la temperatura, es particularmente importante utilizar un método que minimice la pérdida o degradación de la muestra durante la preparación.

Técnica de preparación de extractos	Detalles	Ventajas	Desventajas	Análisis descendente	Referencia
Prensa francesa: Homogeneizador de alta presión (también conocido como Microfluidizer) con pretratamiento enzimático con Zymolyase	Zymolyase-20T, un homogeneizador de alta presión Microfluidizer. El disruptor consiste en una bomba de alta presión accionada por aire (relación 1:250; presión de aire requerida 0,6-l MPa) y una cámara de interrupción especial con una unidad de contrapresión adicional. Se requiere un tamaño mínimo de muestra de 20 ml para el procesamiento.	La interrupción total final obtenida con el protocolo combinado se acercó al 100 % con 4 pasadas a una presión de 95 MPa, en comparación con sólo una interrupción del 32 % con 4 pasadas a 95 MPa utilizando sólo homogeneización sin la Zymolyase.	No es adecuado para aplicaciones a pequeña escala. Las enzimas pueden ser costosas para preparaciones a gran escala.	Purificación de proteínas	6
Batidor de cuentas: Zymolyase células tratadas con dosel con cuentas de vidrio en un instrumento fastprep	Aproximadamente, se añade un volumen igual de cuentas de vidrio frías, secas y lavadas con ácido de 0,5 mm a un volumen determinado de pellet celular en el tampón de la lysis y las células se interrumpen por agitación manual vigorosa.	Es particularmente útil cuando se producen extractos de muchos cultivos de levadura pequeñas diferentes para fines de ensayo en lugar de para la purificación de proteínas.	Durante el procedimiento de perlas de vidrio, las proteínas se tratan duramente causando una espuma extensa que conduce a la desnaturalización de proteínas. La cantidad de rotura celular varía, mientras que la proteólisis, así como la modificación de las proteínas pueden resultar del calentamiento del extracto por encima de 4oC durante la rotura mecánica.	Principalmente análisis de ADN y ARN, pero también análisis de proteínas mediante la desnaturalización de gel electropheoresis, ya sea con o sin hinchazón occidental.	8
Tratamiento con zymolyase seguido de lelisis mediante una combinación de shock osmótico y homogeneización de Dounce	Después de la digestión enzimática de las paredes celulares, los esferoplastos se liszan con 15 a 20 golpes de un pestillo ajustado (despeje de 1 a 3 m) en un homogeneizador dounce.	Ventajoso para usar cepas deficientes en proteasa como BJ926 o EJ101. Esta es la forma más suave de romper las células de levadura y por lo tanto es más adecuado para la preparación de extractos que pueden llevar a cabo funciones enzimáticas complejas (por ejemplo, traducción, transcripción, replicación del ADN) y en las que se debe mantener la integridad de las estructuras macromoleculares (por ejemplo, ribosomas, empalmes). También es útil para aislar núcleos intactos que se pueden utilizar para estudios de cromatina (Bloom y Carbon, 1982) o para extractos de proteínas nucleares (Lue y Kornberg, 1987).	Las principales desventajas del procedimiento de lysis esferoplastia son que es relativamente tedioso y caro, especialmente para preparaciones a gran escala (>10 litros), y los largos períodos de incubación pueden conducir a la proteólisis o modificación de proteínas.  Para las preparaciones de cromatina, parecen ser de diferente o menor calidad que las producidas por la centrifugación diferencial (basada en la integridad de la escalera nucleosoma).	Aislamiento de núcleos intactos para estudios de cromatina, extractos que pueden llevar a cabo funciones enzimáticas complejas, extractos que requieren la integridad de macromoleculares, extractos de proteínas nucleares.	2
Interrupción celular de las células congeladas parpadeantes mediante la molienda de nitrógeno líquido utilizando un mortero/pestle o una licuadora	Las células se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido y luego se aleban moliendo manualmente en un mortero usando un pestillo, o usando una licuadora Waring en presencia de nitrógeno líquido.	El protocolo es rápido y fácil. Puede acomodar diferentes cantidades de células de levadura incluyendo cultivos muy grandes. Su principal ventaja es que las células se toman inmediatamente del estado de crecimiento activo en nitrógeno líquido (-196 oC), disminuyendo las actividades enzimáticas degradativas como proteasas y nucleasas, así como actividades que modifican proteínas (por ejemplo, fosfatasas y quinasas). Es especialmente adecuado para la fabricación de extractos de células enteras de un solo cultivo de levadura para la purificación de proteínas a gran escala.	Un poco desordenado y potencialmente peligroso para el investigador descuidado. Las muestras pequeñas (es decir, cultivos de levadura de 10 a 100 ml) no se procesan fácilmente porque no hay suficiente masa de grumos de células congeladas para fracturarse eficazmente en la licuadora. Es lento procesar muestras individuales y limpiar el equipo entre usos.	Extractos de células enteras de un solo cultivo de levadura para la purificación de proteínas a gran escala.	2
Autolisis, Molino de cuentas	pH 5,0, 50 oC, 24 h, 200 rpm / 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min	La lelisis rápida y eficiente, especialmente para la preparación de extractos a pequeña escala	La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas. Se requiere equipo de batido de cuentas.	Análisis a pequeña escala.	10
Autolisis, Sonicación	pH 5,0, 50 oC, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulsador 80%, potencia 80%	Los equipos de sonicación suelen estar disponibles en la mayoría de las instituciones.	La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas. Se requiere equipo de sonicación. La lelisis lenta puede tardar más de 24 horas.	Preparaciones de la pared celular de levadura.
Proceso de ebullición y congelación	No se necesita ningún equipo especializado que no sea un congelador estándar y un bloque de calefacción o baño de agua caliente.	Eficiente, reproducible, sencillo y barato.	La generación de calor conduce a la desnaturalización y degradación de las macromoléculas.	Análisis de ADN por PCR.	5

Tabla 1: Comparación de los métodos disponibles para la preparación de extractos de levadura.

La criogrinding (también conocida como molienda criogénica/fresado criogénico) se emplea comúnmente para recuperar ácidos nucleicos, proteínas o productos químicos de muestras sensibles a la temperatura de una manera confiable para análisis cuantitativos o cualitativos. Se ha utilizado con éxito para múltiples aplicaciones en diversos campos incluyendo biotecnología, toxicología, ciencias forenses^12,13, ciencia ambiental, biología vegetal¹⁴ y ciencia de los alimentos. El aislamiento de macromoléculas biológicas intactas suele depender críticamente de la temperatura. Las temperaturas extremadamente bajas aseguran que las proteasas y nucleasas permanezcan inactivas, lo que resulta en un aislamiento confiable de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas para análisis posteriores. De hecho, un molino de congelador normalmente mantiene una temperatura de la muestra de -196 oC (el punto de ebullición de LN_2),minimizando así la desnaturalización y degradación del ADN/ARN o de las proteínas.

El molino congelador emplea una cámara de molienda electromagnética que mueve rápidamente una barra de metal sólido o cilindro de ida y vuelta dentro de un vial que contiene la muestra para pulverizar entre tapones de acero inoxidable. El instrumento crea y invierte rápidamente un campo magnético dentro de la cámara de molienda. A medida que el campo magnético se desplaza hacia adelante y hacia atrás, el imán aplasta la muestra contra los enchufes logrando así el “criogrinding” y la pulverización de las palomitas de maíz. El molino congelador reemplaza el mortero y el pestillo y permite el procesamiento secuencial de múltiples muestras (o hasta 4 muestras más pequeñas simultáneamente) con alta reproducibilidad y evita la variabilidad de usuario a usuario asociada con la molienda manual. Una vez procesadas las muestras, los extractos de celdas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores.

Protocol

1. Preparación de palomitas de maíz de levadura Cultivar células de levadura en 0,5 L de medios YPD a una densidad de 1 x 107 células/ml. Cuente las células utilizando un contador coulter o cualquier otro medio. Células centrífugas durante 10 min a 2.400 g y 4oC. Lave cada muestra una vez con 500 ml de agua desionizada en frío de 18 mega Ohm Milli-Q. Pellets de resuspendición en 15 mL de tampón de lisis helada [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0.1% Tween, 10…

Representative Results

Comparamos dos métodos diferentes para la lelisis de células de levadura, a saber, el fresado de cuentas de vidrio a 4 oC y un método automatizado de criogrinding a -196 oC, para evaluar las proteínas de recuperación relativa en los extractos celulares preparados con ambos métodos. Para este estudio, elegimos usar una cepa de levadura en ciernes YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-200 trp1-1[am] ubi1-1::TRP1 ubi-2::ura3 1ubi3-Uub-2 ubi4-2::LEU2 [pUB39] [pUB221])<sup cl…

Discussion

Una limitación del estudio de las proteínas nativas de la levadura es la lisis ineficiente de las células de levadura debido a su pared celular resistente. Aunque se han desarrollado varios métodos, el método más consistente y eficiente en nuestras manos es el criogrinding de las células de levadura flash congelado como palomitas de maíz. Este método permite la preparación confiable de extractos de células enteras de alta calidad de levadura en ciernes en comparación con otros métodos de lysis. Los resultado…

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps	Beckman	357002	Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract	BD Biosiences	212750	Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge	Beckman	B38624	High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous	MP Biomedicals	901521	Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Refrigerated centrifuge
Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Volume excluder and cryoprotectant
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 antibody	Novagen	70796	Antibody for HIS tag
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Salt for maintaining ionic strength
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32957	Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Protein Stain
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32963	Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Sodium Butyrate	EM Science	BX2165-1	Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S6521	Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate	MP Biomedicals	159664	Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill	SPEX Sample Prep	6850	Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin	BD Biosiences	635502	For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Reducing agent