Herstellung von Zellextrakten durch Cryogrinding in einer automatisierten Gefriermühle

Summary

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Herstellung von ganzen Zellextrakten aus Hefe oder anderen Zellen mit hilfe einer kryogenen Gefriermühle, die den Abbau und die Denaturierung von Proteinen minimiert. Die Zellextrakte eignen sich zur Reinigung funktioneller Proteinkomplexe, proteomischer Analysen, Co-Immunpräzipitationsstudien und zum Nachweis von labilen Proteinmodifikationen.

Abstract

Die Leichtigkeit der genetischen Manipulation und die starke evolutionäre Konservierung der eukaryotischen Zellmaschinerie in der angehenden Hefe Saccharomyces cerevisiae hat es zu einem herausragenden genetischen Modellorganismus gemacht. Da jedoch die effiziente Proteinisolierung von einer optimalen Störung der Zellen abhängt, wird die Verwendung von Hefe für die biochemische Analyse zellulärer Proteine durch ihre Zellwand behindert, die teuer zu verdauen ist (mit Lyticase oder Zymolyase), und schwer mechanisch zu stören ist (mit einem traditionellen Perlenschlag, einer französischen Presse oder einem Kaffeeschleifer), ohne eine Erwärmung von Proben zu verursachen, was wiederum zu Proteindenaturierung und Degradation führt. Obwohl das manuelle Schleifen von Hefezellen unter flüssigem Stickstoff (LN₂) mit einem Mörtel und Stößel eine Überhitzung von Proben vermeidet, ist es arbeitsintensiv und unterliegt einer Variabilität der Zelllyse zwischen den Bedienern. Seit vielen Jahren bereiten wir erfolgreich hochwertige Hefeextrakte mit Kryoschleifen von Zellen in einer automatisierten Gefriermühle vor. Die mit LN₂ erreichte Temperatur von -196 °C schützt das biologische Material vor dem Abbau durch Proteasen und Nukleasen und ermöglicht das Abrufen intakter Proteine, Nukleinsäuren und anderer Makromoleküle. Hier beschreiben wir diese Technik im Detail für aufkeimende Hefezellen, bei der zunächst eine Suspension von Zellen in einem Lysepuffer durch ihre tropfenweise Zugabe zu LN₂ eingefroren wird, um gefrorene Zelltröpfchen zu erzeugen, die als “Popcorn” bekannt sind. Dieses Popcorn wird dann unter LN₂ in einer Gefriermühle pulverisiert, um einen gefrorenen “pulverisierten” Extrakt zu erzeugen, der langsam aufgetaut und durch Zentrifugation geklärt wird, um unlösliche Ablagerungen zu entfernen. Die resultierenden Extrakte sind bereit für nachgelagerte Anwendungen wie Protein- oder Nukleinsäurereinigung, proteomische Analysen oder Co-Immunpräzipationsstudien. Diese Technik ist weit verbreitet für die Zellextraktvorbereitung aus einer Vielzahl von Mikroorganismen, pflanzlichen und tierischen Geweben, marinen Proben einschließlich Korallen, sowie die Isolierung von DNA/RNA aus forensischen und Permafrostfossilien.

Introduction

Hefe ist ein beliebter Modellorganismus für Proteinstudien, da es sich um einen einfachen eukaryotischen Organismus mit einer Fülle von genetischen und biochemischen Werkzeugen für Forscher¹. Aufgrund ihrer stabilen Zellwand besteht eine Herausforderung, vor der Forscher stehen, darin, die Zellen effizient zu lysieren, ohne den Zellinhalt zu beschädigen. Verschiedene Methoden sind verfügbar für die Gewinnung von Proteinextrakten durch Störung von Hefezellen, die enzymatische Lyse (Zymolyse)^2,3, chemische Lyse⁴, physikalische Lyse durch Frosttau⁵, druckbasiert (französische Presse)^{6, 7}, mechanisch (Glasperlen, Kaffeemühle)^8,9, beschallungsbasiert¹⁰ und kryogen^2,11. Die Effizienz der Zelllyse und die Proteinausbeute können je nach eingesetzter Technik erheblich variieren, was das Endergebnis oder die Eignung für die gewünschte nachgeschaltete Anwendung für das Lysat beeinflusst. Bei der Untersuchung von Proteinen, die instabil sind, flüchtige posttranslationale Modifikationen aufweisen oder temperaturempfindlich sind, ist es besonders wichtig, eine Methode zu verwenden, die den Probenverlust oder -abbau während der Vorbereitung minimiert.

Extraktvorbereitungstechnik	Details	Vorteile	Nachteile	Downstream-Analyse	Verweis
Französische Presse: Hochdruckhomogenisator (auch Mikrofluidisator genannt) mit enzymatischer Vorbehandlung mit Zymolyase	Zymolyase-20T, ein Mikrofluidizer Hochdruckhomogenisator. Der Disruptor besteht aus einer luftbetriebenen Hochdruckpumpe (Verhältnis 1:250; erforderlicher Luftdruck 0,6-l MPa) und einer speziellen Störkammer mit einer zusätzlichen Gegendruckeinheit. Für die Verarbeitung ist eine Mindestprobengröße von 20 ml erforderlich.	Die endgültige Gesamtstörung, die mit dem kombinierten Protokoll erzielt wurde, näherte sich 100 % mit 4 Durchgängen bei einem Druck von 95 MPa, verglichen mit nur 32 % Störung mit 4 Durchgängen bei 95 MPa, wobei nur die Homogenisierung ohne zymolyase verwendet wurde.	Nicht geeignet für kleine Anwendungen. Die Enzyme können für großflächige Präparate teuer werden.	Proteinreinigung	6
Perlenschläger: Zymolyase behandelte Zellen mit Glasperlen in einem Fastprep-Instrument lysiert	Ungefähr ein gleiches Volumen kalter, trockener, säuregewaschener 0,5 mm Glasperlen wird einem gegebenen Volumen von Zellpellets im Lysepuffer zugesetzt und die Zellen werden durch kräftige manuelle Rührung gestört.	Es ist besonders nützlich, wenn Extrakte aus vielen verschiedenen kleinen Hefekulturen für Assaying-Zwecke statt für die Proteinreinigung zu machen.	Während des Glasperlenverfahrens werden Proteine hart behandelt und verursachen umfangreiches Schaumbildung, was zu einer Proteindenaturierung führt. Die Menge des Zellbruchs variiert, während proteolyse sowie Modifikation der Proteine durch Erwärmung des Extrakts über 4°C während des mechanischen Bruchs entstehen können.	Meistens DNA-RNA-Analysen, aber auch Proteinanalysen durch Denaturierung der Gelelektropheorese, entweder mit oder ohne Western-Blotting.	8
Zymolyase-Behandlung mit anschließender Lyse mit einer Kombination aus osmotischem Schock und Dounce-Homogenisierung	Nach der enzymatischen Verdauung der Zellwände werden Spheroplaste mit 15 bis 20 Strichen eines eng anliegenden Stößeles (Clearance 1 bis 3 m) in einem Dounce Homogenisator lysiert.	Vorteilhaft für die Verwendung von Protease-mangelhaften Stämmen wie BJ926 oder EJ101. Dies ist der sanfteste Weg, Hefezellen zu brechen und eignet sich daher am besten für die Herstellung von Extrakten, die komplexe enzymatische Funktionen (z.B. Translation, Transkription, DNA-Replikation) ausführen können und in denen die Integrität makromolekularer Strukturen (z.B. Ribosomen, Spleißsomen) aufrechterhalten werden muss. Es ist auch nützlich für die Isolierung intakter Kerne, die für Chromatinstudien (Bloom and Carbon, 1982) oder für Kernproteinextrakte (Lue und Kornberg, 1987) verwendet werden können.	Die Hauptnachteile des Spheroplastlyseverfahrens sind, dass es relativ mühsam und teuer ist, insbesondere bei großflächigen Präparaten (>10 Liter), und die langen Inkubationszeiten können zu Proteolyse oder Proteinmodifikation führen.  Bei Chromatinpräparaten scheinen sie eine unterschiedliche oder niedrigere Qualität zu haben als die durch die Differentialzentrifugation erzeugten (basierend auf der Integrität der Nukleosomenleiter).	Isolieren intakter Kerne für Chromatinstudien, Extrakte, die komplexe enzymatische Funktionen ausführen können, Extrakte, die die Integrität makromolekulare Strukturen, Kernproteinextrakte.	2
Zellstörung von Blitz-Gefrierzellen durch Schleifen in Flüssigstickstoff mit einem Mörtel/Pestle oder einem Mixer	Die Zellen werden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann durch manuelles Schleifen in einem Mörtel mit einem Stößel oder mit einem Waring-Mixer in Gegenwart von flüssigem Stickstoff lysiert.	Das Protokoll ist schnell und einfach. Es kann unterschiedliche Mengen an Hefezellen einschließlich sehr großer Kulturen aufnehmen. Sein Hauptvorteil besteht darin, dass Zellen sofort aus dem aktiv wachsenden Zustand in flüssigen Stickstoff (ca. 196 °C) entnommen werden, wodurch abbauende Enzymaktivitäten wie Proteasen und Nukleasen sowie Aktivitäten, die Proteine modifizieren (z. B. Phosphatasen und Kiinasen), abnehmen. Es eignet sich besonders für die Herstellung von Vollzellextrakten aus einer einzigen Hefekultur zur großflächigen Proteinreinigung.	Ein bisschen chaotisch und potenziell gefährlich für den sorglosen Ermittler. Kleine Proben (d. h. 10- bis 100-ml-Hefekulturen) sind nicht leicht zu verarbeiten, da es nicht genügend Masse an gefrorenen Zellklumpen gibt, um effektiv im Mixer zu brechen. Es ist zeitaufwändig, einzelne Proben zu verarbeiten und die Geräte zwischen den Einsatzmöglichkeiten zu reinigen.	Vollzellextrakte aus einer einzigen Hefekultur zur großflächigen Proteinreinigung.	2
Autolyse, Perlenmühle	pH 5,0, 50 °C, 24 h, 200 Umdrehungen pro Minute / x 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min	Schnelle und effiziente Lyse, insbesondere für die kleine Extraktzubereitung	Wärmeerzeugung führt zur Denaturierung und Degradation von Makromolekülen. Perlenschlagen Ausrüstung erforderlich.	Kleine Analysen.	10
Autolyse, Beschallung	pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 Rpm, 4 × 5 min/2 min, Pulser 80%, Leistung 80%	Beschallungsgeräte sind in der Regel in den meisten Institutionen verfügbar.	Wärmeerzeugung führt zur Denaturierung und Degradation von Makromolekülen. Beschallungsausrüstung erforderlich. Die langsame Lyse kann mehr als 24 Stunden dauern.	Hefe-Zell-Wand-Präparate.
Siede- und Gefrier-Tau-Prozess	Außer einem Standard-Gefrierschrank und einem Heizblock oder Warmwasserbad sind keine speziellen Geräte erforderlich.	Effizient, reproduzierbar, einfach und kostengünstig.	Wärmeerzeugung führt zur Denaturierung und Degradation von Makromolekülen.	DNA-Analysen per PCR.	5

Tabelle 1: Vergleich der zur Herstellung von Hefeextrakten verfügbaren Methoden.

Kryoschleifen (auch kryogenes Schleifen/kryogenes Fräsen genannt) wird häufig eingesetzt, um Nukleinsäuren, Proteine oder Chemikalien zuverlässig aus temperaturempfindlichen Proben für quantitative oder qualitative Analysen abzurufen. Es wurde erfolgreich für verschiedene Anwendungen in verschiedenen Bereichen wie Biotechnologie, Toxikologie, Forensik^12,13, Umweltwissenschaften, Pflanzenbiologie¹⁴ und Lebensmittelwissenschaft eingesetzt. Die Isolierung intakter biologischer Makromoleküle ist in der Regel stark von der Temperatur abhängig. Extrem niedrige Temperaturen sorgen dafür, dass die Proteasen und Nukleasen inaktiv bleiben, was zu einer zuverlässigen Isolierung intakter Proteine, Nukleinsäuren und anderer Makromoleküle für nachfolgende Analysen führt. Tatsächlich hält eine Gefriermühle in der Regel eine Probentemperatur von -196 °C (der Siedepunkt von LN₂₎aufrecht, wodurch DNA/RNA oder Proteindenaturierung und -abbau minimiert werden.

Die Gefriermühle verwendet eine elektromagnetische Schleifkammer, die schnell einen festen Metallstab oder Zylinder in einer Durchstechflasche hin und her bewegt, die die Probe enthält, die zwischen Edelstahl-Endsteckern pulverisiert werden soll. Das Instrument erzeugt und kehrt schnell ein Magnetfeld innerhalb der Schleifkammer um. Wenn sich das Magnetfeld hin und her verschiebt, zerkleinert der Magnet die Probe gegen die Stecker und erreicht so das “Kryoschleifen” und die Pulverisierung des Popcorns. Die Gefriermühle ersetzt Mörtel und Stößel und ermöglicht die sequentielle Bearbeitung mehrerer Proben (oder bis zu 4 kleinere Proben gleichzeitig) mit hoher Reproduzierbarkeit und vermeidet die Durchlässigkeit des Benutzers im Zusammenhang mit dem manuellen Schleifen. Sobald die Proben verarbeitet sind, können die Zellextrakte für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen verwendet werden.

Protocol

1. Zubereitung von Hefe-Popcorn Wachsen Sie Hefezellen in 0,5 L YPD-Medien auf eine Dichte von 1 x 107 Zellen/ml. Zählen Sie Zellen mit einem Coulter-Zähler oder anderen Mitteln. Zentrifugenzellen für 10 min bei 2.400 g und 4 °C. Waschen Sie jede Probe einmal mit 500 ml eiskaltem deionisiertem 18 Mega Ohm Milli-Q Wasser. Pellets in 15 ml eiskaltem Lysispuffer [20 mM HEPES-KOH pH pH 7,5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% Glycerin, mit frisch zugesetztem Reduktionsmittel 10 …

Representative Results

Wir verglichen zwei verschiedene Methoden für die Hefezelllyse, nämlich das Glasperlenfräsen bei 4 °C und ein automatisiertes Kryoschleifverfahren bei -196 °C, um die relativen Rückgewinnungsproteine in den mit beiden Methoden hergestellten Zellextrakten zu bewerten. Für diese Studie haben wir uns für einen angehenden Hefestamm YAG 1177 entschieden (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-‘200 trp1-1[am] ubi1-‘1::TRP1 ubi2-‘2::ura3 ubi3-”.1 ub-2 ubi4-2::LEU2 [pUB39] [pUB221])<sup…

Discussion

Eine Einschränkung des Studiums einheimischer Proteine aus Hefe ist die ineffiziente Lyse von Hefezellen aufgrund ihrer harten Zellwand. Obwohl mehrere Methoden entwickelt wurden, ist die konsequenteste und effizienteste Methode in unseren Händen das Kryoschleifen von Hefezellen, die als Popcorn eingefroren sind. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Herstellung von hochwertigen Vollzellextrakten aus angehender Hefe im Vergleich zu anderen Lysemethoden. Die repräsentativen Ergebnisse zeigten, dass Das Kryoschlei…

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps	Beckman	357002	Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract	BD Biosiences	212750	Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge	Beckman	B38624	High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous	MP Biomedicals	901521	Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Refrigerated centrifuge
Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Volume excluder and cryoprotectant
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 antibody	Novagen	70796	Antibody for HIS tag
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Salt for maintaining ionic strength
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32957	Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Protein Stain
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32963	Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Sodium Butyrate	EM Science	BX2165-1	Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S6521	Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate	MP Biomedicals	159664	Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill	SPEX Sample Prep	6850	Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin	BD Biosiences	635502	For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Reducing agent