توصيف خصائص النقل داخل الغضاريف لحاملات الببتيد الموجب
Summary
يحدد هذا البروتوكول امتصاص التوازن وعمق الاختراق ومعدل الانتشار غير المتوازن لحاملي الببتيد الموجب في الغضاريف. توصيف خصائص النقل أمر حاسم لضمان استجابة بيولوجية فعالة. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتصميم ناقلات المخدرات مشحونة على النحو الأمثل لاستهداف الأنسجة المشحونة سلبا.
Abstract
العديد من الأنسجة المشحونة سلبا في الجسم، مثل الغضاريف، تشكل حاجزا أمام تسليم المخدرات المستهدفة بسبب كثافة عالية من aggrecans مشحونة سلبا، وبالتالي، تتطلب أساليب استهداف محسنة لزيادة استجابتها العلاجية. لأن الغضاريف لديها كثافة عالية تهمة ثابتة سلبية، يمكن تعديل الأدوية مع ناقلات المخدرات مشحونة بشكل إيجابي للاستفادة من التفاعلات الكهروستاتيكية، مما يسمح لتعزيز نقل المخدرات داخل الغضاريف. ولذلك، فإن دراسة نقل ناقلي المخدرات أمر بالغ الأهمية للتنبؤ بفعالية العقاقير في الحث على الاستجابة البيولوجية. نعرض تصميم ثلاث تجارب التي يمكن أن تحدد كمية امتصاص التوازن, عمق الاختراق وعدم التوازن معدل الانتشار من حاملات الببتيد الموجبة في explants الغضروف. توفر تجارب امتصاص التوازن مقياسًا لتركيز المذاب داخل الغضاريف مقارنة بالحمام المحيط به ، وهو مفيد للتنبؤ بإمكانات حامل الدواء في تعزيز التركيز العلاجي للأدوية في الغضاريف. عمق دراسات الاختراق باستخدام المجهر confocal تسمح للتمثيل البصري للانتشار 1D من منطقة سطحية إلى منطقة عميقة من الغضاريف، وهو أمر مهم لتقييم ما إذا كانت السولات تصل إلى المصفوفة ومواقعها المستهدفة الخلوية. دراسات معدل الانتشار غير المتوازن باستخدام غرفة نقل مصممة خصيصاً تمكن من قياس قوة التفاعلات الملزمة مع مصفوفة الأنسجة من خلال توصيف معدلات انتشار الفلورسنتات المسماة عبر الأنسجة؛ وهذا مفيد لتصميم الناقلين من قوة الربط الأمثل مع الغضاريف. وتوفر النتائج التي تم الحصول عليها معا من تجارب النقل الثلاث مبادئ توجيهية لتصميم ناقلات المخدرات المشحونة على النحو الأمثل التي تستفيد من تفاعلات الشحن الضعيفة والقابلة للعكس لتطبيقات توصيل المخدرات. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطرائق التجريبية لتقييم نقل المخدرات والاقترانات بين ناقلي المخدرات. علاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه الأساليب للاستخدام في استهداف الأنسجة الأخرى المشحونة سلبا مثل الغضروف المفصلي والقرنية والفكاهة الزجاجي.
Introduction
لا يزال تسليم المخدرات للأنسجة المشحونة سلبا في الجسم تحديا بسبب عدم قدرة المخدرات على اختراق عمق الأنسجة للوصول إلى الخلايا والمصفوفة المواقع المستهدفة1. العديد من هذه الأنسجة تتألف من كثيفة معبأة، واتهم سلبا aggrecans التي تخلق كثافة عالية تهمة ثابتة سالبة (FCD)2 داخل الأنسجة وتعمل كحاجز لتسليم معظم الجزيئاتالكبيرة 3،4. ومع ذلك، بمساعدة من حاملي المخدرات المشحونة إيجابيا، يمكن تحويل هذا الحاجز الأنسجة المشحونة سلبا في الواقع إلى مستودع للمخدرات عن طريق تفاعلات شحنة الكهربائية الساكنة للتسليم المستمر للمخدرات1،5،6،7( الشكل1).
الشكل 1: الشحن القائم على التسليم داخل الغضاريف من CPCs. الحقن داخل المفصل من CPCs في مساحة مفصل الركبة. التفاعلات الكهروستاتيكية بين CPCs مشحونة بشكل إيجابي ومجموعات aggrecan المشحونة بشكل سلبي تمكن من اختراق العمق السريع والكامل من خلال الغضاريف. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami وآخرون4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الآونة الأخيرة، قصير طول الببتيد حاملات (CPCs) تم تصميمها بهدف خلق مجالات الموجبة الصغيرة قادرة على حمل علاجات أكبر الحجم لتسليم الغضروف المشحونة سلبا4. للتسليم الفعال للأدوية إلى الغضروف لعلاج انتشار8,9 والأمراض التنكسية مثل هشاشة العظام (OA)10, فمن الأهمية بمكان أن تتغلغل التركيزات العلاجية للأدوية عميقا داخل الأنسجة, حيث غالبية خلايا الغضاريف (chondrocytes) تكمن11. على الرغم من أن هناك العديد من الأمراض المحتملة تعديل الأدوية المتاحة, لم يحصل أي موافقة ادارة الاغذية والعقاقير لأن هذه غير قادرة على استهداف الغضروف بشكل فعال12,13. ولذلك، فإن تقييم خصائص نقل ناقلي المخدرات ضروري للتنبؤ بفعالية الأدوية في الحث على الاستجابة العلاجية. هنا، قمنا بتصميم ثلاث تجارب منفصلة يمكن استخدامها لتقييم امتصاص التوازن، وعمق الاختراق، ومعدل الانتشار غير المتوازن لCSCS4.
لضمان وجود تركيز كاف من المخدرات داخل الغضاريف التي يمكن أن توفر استجابة علاجية مثلى، تم تصميم تجارب الامتصاص لتحديد التوازن تركيز CPC في الغضاريف4. في هذا التصميم، وبعد التوازن بين الغضروف والحمام المحيطة بها، يمكن تحديد المبلغ الإجمالي من المذاب داخل الغضروف (إما ملزمة إلى المصفوفة أو الحرة) باستخدام نسبة امتصاص. وتحسب هذه النسبة عن طريق تطبيع تركيز solutes داخل الغضاريف إلى أن من حمام التوازن. من حيث المبدأ، فإن السونات المحايدة، التي لا يساعدها التفاعلات الشحنية في انتشارها عبر الغضاريف، سيكون لها نسبة امتصاص أقل من 1. وعلى العكس من ذلك، فإن الوبلوتات الموجبة، التي يتم تعزيز نقلها عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية، تظهر نسبة امتصاص أكبر من 1. ومع ذلك ، كما هو مبين مع CPCs ، يمكن أن يؤدي استخدام الشحنة الإيجابية المثلى إلى نسب امتصاص أعلى بكثير (أكبر من 300)4.
على الرغم من أن تركيز المخدرات العالية داخل الغضروف مهم لتحقيق فائدة علاجية ، إلا أنه من المهم أيضًا أن تنتشر الأدوية من خلال السماكة الكاملة للغضاريف. ولذلك، هناك حاجة إلى دراسات تبين عمق الاختراق لضمان وصول الأدوية إلى عمق الغضاريف حتى يمكن الوصول إلى مواقع المصفوفة والخلايا المستهدفة، وبالتالي توفير علاج أكثر فعالية. وقد صُممت هذه التجربة لتقييم انتشار الوبات في اتجاه واحد من خلال الغضاريف، محاكياً انتشار المخدرات في الغضاريف بعد الحقن داخل المفصلي في الجسم الحي. يسمح التصوير الفلوري باستخدام المجهر الناسخ بتقييم عمق الاختراق في الغضاريف. صافي الجسيمات تهمة تلعب دورا رئيسيا في الاعتدال كيف المخدرات العميقة يمكن أن تنتشر من خلال المصفوفة. مطلوب الشحن الصافي الأمثل على أساس FCD الأنسجة للسماح لتفاعلات الربط ضعيفة قابلة للعكس بين الجسيمات الموجبة ومصفوفة الأنسجة anionic. وهذا يعني أن أي تفاعل ضعيف بما فيه الكفاية بحيث يمكن للجسيمات أن تنأى عن المصفوفة ولكن يمكن عكسها في الطبيعة بحيث يمكن ربطها بموقع ملزم آخر داخل النسيج4. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تكون الشحنة الصافية الموجبة المفرطة للجسيمات ضارة نحو الانتشار، حيث أن ربط المصفوفة القوي جداً يمنع انفصال الجسيمات عن موقع الربط الأولي في المنطقة السطحية للغضاريف. وهذا من شأنه أن يؤدي إلى استجابة بيولوجية غير كافية لأن غالبية المواقع المستهدفة تقع في عمق الأنسجة11.
لمزيد من التحديد الكمي لقوة التفاعلات الملزمة ، فإن تحليل معدلات انتشار المخدرات من خلال الغضاريف مفيد. دراسات الانتشار غير المتوازن تسمح بمقارنة معدلات الانتشار في الوقت الحقيقي بين مختلف العاهرات. كما تنتشر المخدرات من خلال المناطق السطحية والوسطى والعميقة للغضاريف، وجود التفاعلات ملزمة يمكن أن تغير إلى حد كبير معدلات الانتشار. عندما تكون التفاعلات الملزمة موجودة بين الأدوية ومصفوفة الغضاريف ، يتم تعريفها على أنها الناشرة الفعالة (DEFF). في هذه الحالة، مرة واحدة وقد تم شغل جميع المواقع ملزمة، ويخضع معدل انتشار المخدرات من قبل انتشار ثابت الدولة (DSS). المقارنة بين DEFF من مذاب مختلفة يحدد قوة الربط النسبية من solutes مع المصفوفة. بالنسبة لملذاب معين، إذا كان DEFF وDSS ضمن نفس الترتيب من الحجم، فإنه يعني أن هناك الحد الأدنى من الربط الحالي بين المخدرات والمصفوفة أثناء الانتشار. ومع ذلك، إذا كان DEFF أكبر من DSS، فإن الربط الكبير للجسيمات إلى المصفوفة موجود.
التجارب المصممة تسمح بشكل فردي لتوصيف النقل المذاب من خلال الغضاريف ، ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تحليل شامل شامل لجميع النتائج لتصميم ناقل مخدرات مشحون على النحو الأمثل. تتحكم الطبيعة الضعيفة والقابلة للعكس في تفاعلات الشحن في معدل انتشار الجسيمات وتسمح باستخلاص توازن عالي واختراق العمق الكامل السريع من خلال الغضاريف. ومن خلال تجارب امتصاص التوازن، ينبغي أن نبحث عن حاملات تظهر درجة عالية من الإقبال نتيجة لتفاعلات الشحن التي يمكن التحقق منها باستخدام دراسات معدل الانتشار غير المتوازن. ومع ذلك، ينبغي أن تكون هذه التفاعلات ملزمة ضعيفة وعكسها في الطبيعة للسماح لاختراق كامل سمك من المنقلب من خلال الغضاريف. الناقل المثالي للمخدرات تمتلك تهمة الأمثل الذي يتيح قوية بما فيه الكفاية ملزمة لامتصاص وارتفاع داخل الغضاريف المخدرات التركيزات، ولكن ليس قوية جدا لعرقلة نشر كامل سمك4. وستساعد التجارب المعروضة في خصائص تصميم الأنسجة القائمة على الرسوم التي تستهدف حاملي المخدرات. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لتميز نقل الحزب الشيوعى الصينى من خلالالغضروف 4، ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه على مجموعة متنوعة من المخدرات وحاملي المخدرات من خلال الغضاريف وغيرها من الأنسجة المشحونة سلبا.
Protocol
Representative Results
Discussion
10- إن الأساليب والبروتوكولات المذكورة هنا هامة في مجال تسليم الأدوية المستهدفة للأنسجة المشحونة سلباً. بسبب الكثافة العالية لل aggrecans المشحونة سلبا الموجودة في هذه الأنسجة، يتم إنشاء حاجز، وبالتالي منع الأدوية من الوصول إلى مواقعها المستهدفة الخلوية التي تقع في عمق المصفوفة. للتصدي لهذا ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع الأمريكية من خلال برامج البحوث الطبية الموجهة من الكونغرس (CDMRP) بموجب العقد W81XWH-17-1-0085، والمعهد الوطني للصحة R03 EB025903-1. تم تمويل AV من قبل زمالة عميد كلية الهندسة في جامعة نورث إيسترن.
Materials
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18×18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7×2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
Referenzen
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis – An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
