Karakterisering van intrakraakbeen transport eigenschappen van Cationic Peptide Carriers

Summary

Dit protocol bepaalt evenwichtsopname, penetratiediepte en niet-evenwichtsdiffusiepercentage voor kationische peptidedragers in kraakbeen. Karakterisering van transporteigenschappen is van cruciaal belang voor een effectieve biologische respons. Deze methoden kunnen worden toegepast voor het ontwerpen van een optimaal geladen drug dragers voor het richten van negatief geladen weefsels.

Abstract

Verschillende negatief geladen weefsels in het lichaam, zoals kraakbeen, vormen een barrière voor de gerichte levering van geneesmiddelen vanwege hun hoge dichtheid van negatief geladen aggrecans en vereisen daarom verbeterde targetingmethoden om hun therapeutische respons te verhogen. Omdat kraakbeen een hoge negatieve vaste ladingsdichtheid heeft, kunnen geneesmiddelen worden gewijzigd met positief geladen geneesmiddelendragers om te profiteren van elektrostatische interacties, waardoor een verbeterd intrakraakbeentransport mogelijk is. Het bestuderen van het vervoer van drugsdragers is daarom van cruciaal belang om de werkzaamheid van geneesmiddelen te voorspellen die een biologische respons opwekken. We tonen het ontwerp van drie experimenten die de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en niet-evenwichtsdiffusiesnelheid van kationische peptidedragers in kraakbeenexplants kunnen kwantificeren. Evenwichtsopname-experimenten bieden een maat voor de oplosconcentratie in het kraakbeen in vergelijking met het omringende bad, wat handig is voor het voorspellen van het potentieel van een geneesmiddelendrager bij het verbeteren van de therapeutische concentratie van geneesmiddelen in kraakbeen. Diepte van penetratiestudies met behulp van confocale microscopie zorgen voor de visuele weergave van 1D-oplosmiddeldiffusie van de oppervlakkige tot diepe zone van kraakbeen, wat belangrijk is om te beoordelen of solutes hun matrix- en cellulaire doelsites bereiken. Niet-evenwichtsdiffusiegraadstudies met behulp van een op maat ontworpen transportkamer maakt het mogelijk de sterkte van bindingsinteracties met de weefselmatrix te meten door de diffusiesnelheden van fluorescerende gelabelde solutes over het weefsel te karakteriseren; dit is gunstig voor het ontwerpen van dragers van optimale bindingssterkte met kraakbeen. Samen vormen de resultaten van de drie vervoersexperimenten een richtlijn voor het ontwerpen van optimaal geladen geneesmiddelendragers die profiteren van zwakke en omkeerbare ladingsinteracties voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen. Deze experimentele methoden kunnen ook worden toegepast om het vervoer van drugs en drug-drug carrier conjugaats te evalueren. Verder kunnen deze methoden worden aangepast voor het gebruik bij het richten van andere negatief geladen weefsels zoals meniscus, hoornvlies en de glasachtige humor.

Introduction

Drug-levering aan negatief geladen weefsels in het lichaam blijft een uitdaging als gevolg van het onvermogen van geneesmiddelen om diep door te dringen in het weefsel om cel en matrix doelsites¹te bereiken. Een aantal van deze weefsels bestaat uit dicht verpakte, negatief geladen aggrecans die een hoge negatieve vaste ladingsdichtheid (FCD)² in het weefsel creëren en fungeren als een barrière voor de levering van de meeste macromoleculen^3,4. Echter, met de hulp van positief geladen drugsdragers, kan deze negatief geladen weefselbarrière daadwerkelijk worden omgezet in een medicijndepot via elektrostatische ladingsinteracties voor aanhoudende levering van geneesmiddelen^1,5,6,7( figuur1).

Figuur 1: Op kosten gebaseerde intrakraakbeenlevering van CPC’s. Intra-articulaire injectie van CPC’s in de kniegewrichtruimte. Elektrostatische interacties tussen positief geladen CPC’s en negatief geladen aggrecangroepen maken een snelle en volledige dieptepenetratie door kraakbeen mogelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Onlangs, korte lengte cationic peptide dragers (CPC’s) werden ontworpen met het doel van het creëren van kleine kationische domeinen in staat het dragen van grotere grootte therapeutica voor de levering aan de negatief geladen kraakbeen⁴. Voor effectieve levering van geneesmiddelen aan het kraakbeen voor de behandeling van heersende^8,,9 en degeneratieve ziekten zoals artrose (OA)¹⁰, is het van cruciaal belang dat therapeutische concentraties van geneesmiddelen diep in het weefsel doordringen, waar een meerderheid van de kraakbeencellen (chondrocyten)¹¹liggen. Hoewel er verschillende potentiële ziekte wijzigen van geneesmiddelen beschikbaar zijn, geen hebben opgedaan FDA goedkeuring, omdat deze niet in staat zijn om effectief te richten op het^{kraakbeen 12,13}. Daarom is evaluatie van de transporteigenschappen van drugsdragers noodzakelijk om de effectiviteit van geneesmiddelen te voorspellen die een therapeutische respons opwekken. Hier hebben we drie afzonderlijke experimenten ontworpen die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en de verspreidingsgraad van CPC’s⁴zonder evenwicht.

Om ervoor te zorgen dat er een voldoende medicijnconcentratie in het kraakbeen is die een optimale therapeutische respons kan bieden, werden opname-experimenten ontworpen om de CPC-concentratie in kraakbeen⁴te kwantificeren. In dit ontwerp, na een evenwicht tussen het kraakbeen en het omringende bad, kan de totale hoeveelheid oplosmiddel in het kraakbeen (gebonden aan de matrix of vrij) worden bepaald met behulp van een opnameverhouding. Deze verhouding wordt berekend door de concentratie van oplosmiddel in het kraakbeen te normaliseren tot die van het evenwichtsbad. In principe zou neutrale oplosmiddel, waarvan de verspreiding door het kraakbeen niet wordt bijgestaan door ladingsinteracties, een opnameverhouding van minder dan 1 hebben. Omgekeerd vertonen kationische oplosmiddelen, waarvan het transport wordt verbeterd via elektrostatische interacties, een opnameverhouding van meer dan 1. Zoals blijkt uit CPC’s kan het gebruik van een optimale positieve lading echter leiden tot een veel hogere opnameratio (groter dan 300)⁴.

Hoewel een hoge medicijnconcentratie in het kraakbeen belangrijk is voor het bereiken van therapeutisch voordeel, is het ook van cruciaal belang dat geneesmiddelen zich verspreiden door de volledige dikte van het kraakbeen. Daarom zijn studies die de diepte van penetratie laten zien nodig om ervoor te zorgen dat geneesmiddelen diep in het kraakbeen reiken, zodat de matrix- en cellulaire doellocaties kunnen worden bereikt, waardoor een effectievere therapie wordt geboden. Dit experiment was ontworpen om de eenrichtingspreiding van oplosmiddelen door kraakbeen te beoordelen, waarbij de verspreiding van geneesmiddelen in kraakbeen na intra-articulaire injectie in vivo werd gesimuleerd. Fluorescentie beeldvorming met behulp van confocale microscopie zorgt voor de evaluatie van de diepte van penetratie in kraakbeen. Netto deeltjeslading speelt een belangrijke rol bij het matigen van hoe diepe geneesmiddelen zich door de matrix kunnen verspreiden. Een optimale nettolading op basis van een weefsel FCD is vereist om zwakke-omkeerbare binding interacties tussen kationische deeltjes en de anionische weefselmatrix mogelijk te maken. Dit houdt in dat elke interactie zwak genoeg is, zodat deeltjes zich kunnen loskoppelen van de matrix, maar omkeerbaar van aard, zodat het kan binden aan een andere matrix binding site dieper in het weefsel⁴. Omgekeerd kan een overmatige positieve nettolading van een deeltje schadelijk zijn voor diffusie, omdat een te sterke matrixbinding het losmaken van deeltjes van de oorspronkelijke bindingsplaats in de oppervlakkige zone van kraakbeen verhindert. Dit zou resulteren in een onvoldoende biologische respons, aangezien een meerderheid van de doellocaties diep in het weefsel ligt¹¹.

Om de sterkte van de bindende interacties verder te kwantificeren, is analyse van de verspreidingssnelheden van geneesmiddelen via kraakbeen voordelig. Niet-evenwichtsdiffusiestudies maken het mogelijk om real-time diffusiepercentages tussen verschillende oplospercentages te vergelijken. Als geneesmiddelen verspreiden door de oppervlakkige, middelste en diepe zones van kraakbeen, de aanwezigheid van bindende interacties kan sterk veranderen diffusie tarieven. Wanneer bindende interacties aanwezig zijn tussen geneesmiddelen en de kraakbeenmatrix, wordt deze gedefinieerd als de effectieve diffusiviteit (D_EFF). In dit geval, zodra alle bindende plaatsen zijn bezet, wordt het verspreidingspercentage van drugs beheerst door de steady-state diffusie (D_SS). Vergelijking tussen de D_EFF van verschillende oplosmiddel bepaalt de relatieve bindende sterkte van de oplosmiddel met de matrix. Voor een bepaalde oplosmiddel, als de D_EFF en D_SS binnen dezelfde orde van grootte zijn, impliceert dit dat er minimale binding aanwezig is tussen het medicijn en de matrix tijdens diffusie. Als D_EFF echter groter is dan D_SS,bestaat er een aanzienlijke binding van deeltjes aan matrix.

De ontworpen experimenten individueel zorgen voor de karakterisering van het vervoer oplosbaar door het kraakbeen, echter, een holistische analyse inclusief alle resultaten is vereist voor het ontwerpen van een optimaal geladen drug drager. De zwakke en omkeerbare aard van lading interacties regelt deeltjes diffusie en zorgt voor een hoge evenwichtsopname en snelle volledige diepte penetratie door kraakbeen. Door middel van experimenten met evenwichtsopnames moeten we zoeken naar dragers die een hoge opname vertonen als gevolg van ladingsinteracties die kunnen worden geverifieerd met behulp van niet-evenwichtsdiffusieratiostudies. Deze bindende interacties moeten echter zwak en omkeerbaar van aard zijn om volledige diktepenetratie van het oplosmiddel door kraakbeen mogelijk te maken. Een ideale drug drager zou beschikken over een optimale lading die het mogelijk maakt sterk genoeg binding voor opname en hoge intra-kraakbeen drug concentraties, maar niet te sterk om volledige dikte diffusie⁴belemmeren. De gepresenteerde experimenten zullen helpen bij de ontwerpkenmerken voor op lading gebaseerd weefsel gericht op geneesmiddelendragers. Deze protocollen werden gebruikt voor het karakteriseren van CPC-transport via^{kraakbeen 4,}maar deze kunnen ook worden toegepast op een verscheidenheid van geneesmiddelen en drugsdragers via kraakbeen en andere negatief geladen weefsels.

Protocol

Universitaire goedkeuringen werden verkregen voor het uitvoeren van de experimenten met dode weefsels. Runderverbindingen werden commercieel verkregen uit een slachthuis. 1. Kraakbeenexplant extractie Met behulp van een scalpel (#10 blad), knippen en verwijderen van vet, spieren, ligamenten, pezen en alle andere bindweefsel om het kraakbeen bloot te stellen van de femoropatellar groef van runderkniegewrichten. Met behulp van 3 mm en 6 mm huidstoten, maak loodrecht stoten in…

Representative Results

Na evenwichtsabsorptie van CPC’s door kraakbeen neemt de badfluorescentie af wanneer het oplosmiddel door het weefsel is opgenomen. Echter, als de fluorescentie waarde van het uiteindelijke bad blijft vergelijkbaar met de eerste, het geeft aan dat er geen / minimale oplosmiddel opname. Een andere bevestiging van de opname van solute is als het weefsel zichtbaar van kleur is veranderd in de kleur van de fluorescerende kleurstof. De kwantitatieve opname van oplosmiddel in kraakbeen werd bepaald aan de hand van de opnamever…

Discussion

De methoden en protocollen die hier worden beschreven zijn belangrijk voor het gebied van gerichte levering van geneesmiddelen aan negatief geladen weefsels. Vanwege de hoge dichtheid van negatief geladen aggrecans aanwezig in deze weefsels, wordt een barrière gecreëerd, waardoor drugs hun cellulaire doelsites die diep in de matrix liggen, niet bereiken. Om deze nog opmerkelijke uitdaging het land aan te pakken, kunnen geneesmiddelen worden aangepast om positief geladen drugsdragers op te nemen die het vervoerspercenta…

Materials

316 Stainless Steel SAE Washer	McMaster-Carr	91950A044	For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate	Fisherbrand	12566620	Black
Acrylic Thick Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	100x
Bovine Cartilage	Research 87	N/A	2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Custom designed peptide
CPC+20	LifeTein	LT1525	Custom designed peptide
CPC+8	LifeTein	LT1523	Custom designed peptide
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Dermal Punch	MedBlades	MB5-1	3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning Costar	3595	Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film	Bemis Parafilm M Laboratory	1337412
Gold Seal Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	6378701	# 1.5, 18×18 mm
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A15	1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A19	3/4" Diameter
Laser	Chroma Technology	AT480/30m	Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7×2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet	McMaster-Carr	1370N12	1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk	Sigma Aldrich	M7409
Petri Dish	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CMR	1x
Plate Shaker	VWR	89032-088
Protease Inhibitors	Thermo Scientific	A32953
Razor Blades	Fisherbrand	12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	Black transport chamber inserts
RTV Silicone	Loctite	234323	Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel	TedPella	549-3	#10, #11 blades
Signal Receiver	Chroma Technology	ET515lp	Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22363204	1.5 mL
Spatula	TedPella	13508
Synergy H1 Microplate Reader	Biotek	H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Thread size, 1" Long