Caratterizzazione delle proprietà di trasporto intra-cartilagine dei portatori di peptidi cationici

Summary

Questo protocollo determina l’assorbimento dell’equilibrio, la profondità di penetrazione e il tasso di diffusione non di equilibrio per i portatori di peptidi cationici nella cartilagine. La caratterizzazione delle proprietà di trasporto è fondamentale per garantire una risposta biologica efficace. Questi metodi possono essere applicati per la progettazione di un vettore di droga carica in modo ottimale per indirizzare i tessuti caricati negativamente.

Abstract

Diversi tessuti caricati negativamente nel corpo, come la cartilagine, presentano una barriera alla consegna mirata del farmaco a causa della loro alta densità di aggrecans caricati negativamente e, quindi, richiedono metodi di targeting migliorati per aumentare la loro risposta terapeutica. Poiché la cartilagine ha un’alta densità di carica fissa negativa, i farmaci possono essere modificati con vettori di farmaci caricati positivamente per sfruttare le interazioni elettrostatiche, consentendo un migliore trasporto di farmaci intra-cartilagine. Studiare il trasporto dei portatori di farmaci è quindi fondamentale per prevedere l’efficacia dei farmaci nell’indurre una risposta biologica. Mostriamo la progettazione di tre esperimenti che possono quantificare l’assorbimento dell’equilibrio, la profondità di penetrazione e il tasso di diffusione non di equilibrio dei portatori di peptidi cationici negli espianti della cartilagine. Gli esperimenti di assorbimento dell’equilibrio forniscono una misura della concentrazione soluta all’interno della cartilagine rispetto al bagno circostante, che è utile per prevedere il potenziale di un vettore di farmaci nell’migliorare la concentrazione terapeutica di farmaci nella cartilagine. La profondità degli studi di penetrazione mediante microscopia confocale consente la rappresentazione visiva della diffusione del soluto 1D dalla zona superficiale a quella profonda della cartilagine, che è importante per valutare se i soluti raggiungono la loro matrice e i siti di destinazione cellulare. Gli studi sul tasso di diffusione non-equilibrio utilizzando una camera di trasporto progettata su misura consentono di misurazione della forza delle interazioni leganti con la matrice tissunte caratterizzando i tassi di diffusione dei soluti fluoreescenti etichettati attraverso il tessuto; questo è utile per la progettazione di vettori di forza di legame ottimale con cartilagine. Insieme, i risultati ottenuti dai tre esperimenti di trasporto forniscono una linea guida per la progettazione di vettori di farmaci a pagamento in modo ottimale che sfruttano interazioni di carica deboli e reversibili per le applicazioni di consegna di farmaci. Questi metodi sperimentali possono anche essere applicati per valutare il trasporto di farmaci e coniugati porta-droga. Inoltre, questi metodi possono essere adattati per l’uso nel targeting di altri tessuti caricati negativamente come menisco, cornea e l’umorismo vitreo.

Introduction

La consegna di farmaci a tessuti caricati negativamente nel corpo rimane una sfida a causa dell’incapacità dei farmaci di penetrare in profondità nel tessuto per raggiungere i siti di destinazione delle cellule e delle^{matrici 1}. Molti di questi tessuti comprendono aggrecans densamente imballati e caricati negativamente che creano un’alta densità di carica fissa negativa (FCD)^{2 all’interno} del tessuto e fungono da barriera per la consegna della maggior parte delle macromolecole^3,4. Tuttavia, con l’assistenza di portatori di farmaci caricati positivamente, questa barriera tissunte carica negativamente può effettivamente essere convertita in un deposito di farmaci tramite interazioni di carica elettrostatica per la consegna sostenuta^{di farmaci 1,5,6,7}( Figura1).

Figura 1: Consegna intra-cartilagine basata sulla carica di CPC. Iniezione intra-articolare di CPC nello spazio dell’articolazione del ginocchio. Le interazioni elettrostatiche tra CPC caricati positivamente e gruppi aggrecan caricati negativamente consentono una penetrazione rapida e completa della profondità attraverso la cartilagine. Questa cifra è stata modificata da Vedadghavami et al⁴. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Recentemente, i portatori di peptidi cationici di breve lunghezza (CPC) sono stati progettati con l’obiettivo di creare piccoli domini cationici in grado di trasportare terapie di dimensioni maggiori per la consegna alla cartilagine^4. Per la consegna efficace di farmaci alla cartilagine per il trattamento prevalente^8,9 e malattie degenerative come l’osteoartrite (OA)¹⁰, è fondamentale che le concentrazioni terapeutiche dei farmaci penetrino in profondità all’interno del tessuto, dove la maggior parte delle cellule della cartilagine (condrociti)^{si trovano 11}. Anche se ci sono diversi potenziali farmaci di modifica della malattia disponibili, nessuno ha ottenuto l’approvazione FDA perché questi non sono in grado di indirizzare efficacemente la^{cartilagine 12,13}. Pertanto, la valutazione delle proprietà di trasporto dei portatori di farmaci è necessaria per prevedere l’efficacia dei farmaci nell’indurre una risposta terapeutica. Qui, abbiamo progettato tre esperimenti separati che possono essere utilizzati per valutare l’assorbimento dell’equilibrio, la profondità di penetrazione e il tasso di diffusione non di equilibrio dei CPC⁴.

Per garantire una concentrazione di droga sufficiente all’interno della cartilagine in grado di fornire una risposta terapeutica ottimale, sono stati progettati esperimenti di assorbimento per quantificare la concentrazione di CPC di equilibrio nella cartilagine⁴. In questo disegno, a seguito di un equilibrio tra la cartilagine e il bagno circostante, la quantità totale di soluto all’interno della cartilagine (sia legata alla matrice o libera) può essere determinata utilizzando un rapporto di assorbimento. Questo rapporto viene calcolato normalizzando la concentrazione di solute all’interno della cartilagine a quella del bagno di equilibrio. In linea di principio, i solute neutri, la cui diffusione attraverso la cartilagine non è assistita da interazioni di carica, avrebbero un rapporto di assorbimento inferiore a 1. Al contrario, i solti cationici, il cui trasporto è migliorato tramite interazioni elettrostatiche, mostrano un rapporto di assorbimento maggiore di 1. Tuttavia, come mostrato con i CPC, l’uso di una carica positiva ottimale può comportare rapporti di assorbimento molto più elevati (maggiori di 300)⁴.

Anche se l’alta concentrazione di farmaci all’interno della cartilagine è importante per ottenere benefici terapeutici, è anche fondamentale che i farmaci si diffondano attraverso l’intero spessore della cartilagine. Pertanto, gli studi che mostrano la profondità di penetrazione sono necessari per garantire che i farmaci raggiungano in profondità all’interno della cartilagine in modo che la matrice e siti bersaglio cellulare possono essere raggiunti, fornendo così una terapia più efficace. Questo esperimento è stato progettato per valutare la diffusione a senso unico dei soluti attraverso la cartilagine, simulando la diffusione dei farmaci nella cartilagine a seguito di iniezione intra-articolare in vivo. L’imaging a fluorescenza mediante microscopia confocale consente di valutazione della profondità di penetrazione nella cartilagine. La carica netta di particelle gioca un ruolo chiave nel moderare il modo in cui i farmaci profondi possono diffondersi attraverso la matrice. È necessaria una carica netta ottimale basata su un FCD di tessuto per consentire interazioni di legame debole reversibile tra particelle cationiche e la matrice del tessuto aninico. Ciò implica che qualsiasi interazione è abbastanza debole in modo che le particelle possano dissociare dalla matrice ma reversibile in natura in modo che possa legarsi a un altro sito di legame di matrice più in profondità all’interno^{del tessuto 4}. Al contrario, un’eccessiva carica netta positiva di una particella può essere dannosa per la diffusione, poiché un legame di matrice troppo forte impedisce il distacco delle particelle dal sito di legame iniziale nella zona superficiale della cartilagine. Ciò comporterebbe una risposta biologica insufficiente in quanto la maggior parte dei siti di destinazione si trovano in profondità all’interno del tessuto¹¹.

Per quantificare ulteriormente la forza delle interazioni vincolanti, l’analisi dei tassi di diffusione dei farmaci attraverso la cartilagine è vantaggiosa. Gli studi di diffusione non di equilibrio consentono di confrontare i tassi di diffusione in tempo reale tra i diversi solute. Poiché i farmaci si diffondono attraverso le zone superficiali, medie e profonde della cartilagine, la presenza di interazioni vincolanti può alterare notevolmente i tassi di diffusione. Quando sono presenti interazioni vincolanti tra i farmaci e la matrice della cartilagine, è definita come la diffusione effettiva (D_EFF). In questo caso, una volta che tutti i siti di rilegatura sono stati occupati, il tasso di diffusione dei farmaci è regolato dalla diffusione a stato costante (D_SS). Il confronto tra il_FEP D di soluto diverso determina l’intensità di legame relativo dei solute con la matrice. Per un dato soluto, se il_{D EFF e} D_SS sono all’interno dello stesso ordine di grandezza, implica che vi è un legame minimo presente tra il farmaco e la matrice durante la diffusione. Tuttavia, se D_{EFF è} maggiore di D_SS, esiste un sostanziale legame delle particelle alla matrice.

Gli esperimenti progettati individualmente consentono la caratterizzazione del trasporto soluto attraverso la cartilagine, tuttavia, è necessaria un’analisi olistica che include tutti i risultati per la progettazione di un vettore di farmaci a carica ottimale. La natura debole e reversibile delle interazioni di carica controlla il tasso di diffusione delle particelle e consente un elevato assorbimento dell’equilibrio e una rapida penetrazione della profondità completa attraverso la cartilagine. Attraverso esperimenti di assorbimento dell’equilibrio, dovremmo cercare i vettori che mostrano un elevato assorbimento a seguito di interazioni di carica che possono essere verificate utilizzando studi sul tasso di diffusione non-equilibrio. Tuttavia, queste interazioni vincolanti dovrebbero essere deboli e reversibili in natura per consentire una penetrazione a pieno spessore del soluto attraverso la cartilagine. Un vettore di droga ideale sarebbe in possesso di una carica ottimale che consente un legame abbastanza forte per l’assorbimento e alte concentrazioni di farmaci intra-cartilagine, ma non troppo forte da ostacolare la diffusione a pieno spessore⁴. Gli esperimenti presentati aiuteranno nelle caratteristiche progettuali per i vettori di farmaci basati sulla carica. Questi protocolli sono stati utilizzati per caratterizzare il trasporto CPC attraverso la cartilagine⁴, tuttavia, questi possono essere applicati anche a una varietà di farmaci e portatori di farmaci attraverso la cartilagine e altri tessuti caricati negativamente.

Protocol

Sono state ottenute approvazioni universitarie per condurre gli esperimenti con tessuti morti. Le articolazioni bovine sono state ottenute commercialmente da un macello. 1. Estrazione espianto della cartilagine Utilizzando un bisturi (lama #10), tagliare e rimuovere grasso, muscoli, legamenti, tendini e tutto il tessuto connettivo per esporre la cartilagine dalla scanalatura femoropatellare delle articolazioni del ginocchio bovino. Utilizzando punzoni dermici da 3 mm e 6 mm…

Representative Results

Dopo l’assorbimento dell’equilibrio dei CPC per cartilagine, la fluorescenza del bagno diminuisce quando il soluto è stato risvegliato dal tessuto. Tuttavia, se il valore di fluorescenza del bagno finale rimane simile all’iniziale, indica che non vi è alcun/minimo soluto. Un’altra conferma dell’assorbimento soluto è se il tessuto ha visibilmente cambiato colore al colore del colorante fluorescente. L’assorbimento quantitativo dei soluti nella cartilagine è stato determinato utilizzando il rapporto di assorbimento (R<…

Discussion

I metodi e i protocolli qui descritti sono significativi per il campo della consegna mirata di farmaci ai tessuti caricati negativamente. A causa dell’alta densità di aggrecans caricati negativamente presenti in questi tessuti, viene creata una barriera, impedendo così ai farmaci di raggiungere i loro siti di destinazione cellulari che si trovano in profondità all’interno della matrice. Per affrontare questa sfida in sospeso, i farmaci possono essere modificati per incorporare vettori di droga caricati positivamente c…

Materials

316 Stainless Steel SAE Washer	McMaster-Carr	91950A044	For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate	Fisherbrand	12566620	Black
Acrylic Thick Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	100x
Bovine Cartilage	Research 87	N/A	2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Custom designed peptide
CPC+20	LifeTein	LT1525	Custom designed peptide
CPC+8	LifeTein	LT1523	Custom designed peptide
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Dermal Punch	MedBlades	MB5-1	3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning Costar	3595	Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film	Bemis Parafilm M Laboratory	1337412
Gold Seal Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	6378701	# 1.5, 18×18 mm
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A15	1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A19	3/4" Diameter
Laser	Chroma Technology	AT480/30m	Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7×2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet	McMaster-Carr	1370N12	1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk	Sigma Aldrich	M7409
Petri Dish	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CMR	1x
Plate Shaker	VWR	89032-088
Protease Inhibitors	Thermo Scientific	A32953
Razor Blades	Fisherbrand	12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	Black transport chamber inserts
RTV Silicone	Loctite	234323	Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel	TedPella	549-3	#10, #11 blades
Signal Receiver	Chroma Technology	ET515lp	Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22363204	1.5 mL
Spatula	TedPella	13508
Synergy H1 Microplate Reader	Biotek	H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Thread size, 1" Long